定量PCR中RO作用分析和总结.docxVIP

Master Mix 试剂液都预掺入最合适量的 Master Mix 试剂液都预掺入最合适量的 Rox?参比染料，从而确保每次实验每个反应都获得最好的结果。 Rox?校正单次反应运行中的信号改变 在理想反应条件下，报告荧光染料的信号值起始于基线，当反应体系中存在合适的靶分子时，报告荧光染 料会随着 PCR 反应的进行，产生出一条典型的扩增曲线，仪器软件通过扩增曲线计算结果。如果扩增曲线只是简单地根据报告染料的荧光信号而绘制，将会难以区分样品的真实差异和随机反应条件带来的人为差异。现实中，有许多事件可能影响报告荧光染料的表现：泡沫会形成荧光信号尖峰；蒸发或冷凝会造成反应体系浓度改变，导致不同反应批次间荧光信号值增强或减弱(见图 1)。这类事件会同时影响报告荧光染料和 Rox?参比染料，所以使用AB 的定量试剂与仪器时，根据Rn 值绘制扩增曲线，采集的是报告荧光染料减去 Rox?参比染料的荧光差值，任何潜在的人为误差因素都被均一化，从而排除在最终结果之外。 使用Rox?的好处 —确保您获得均一的定量PCR 实验结果。 某些不含有 Rox?均一化参比染料，或是无法在整个实验过程中使用参比染料的定量PCR 平台，常常试图贬 低使用参比染料的价值。然而事实是，在定量PCR 反应过程中 Rox?染料是一种非常有价值的工具，能带来以下多方面好处： 校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变； 校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变； 为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受 PCR 反应影响； 均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异； 均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复 Ct 值。 ? 美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)认识到均一化工具(Rox?参比染料)的好处，并在所有 AB 定量 美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)认识到均一化工具(Rox?参比染料)的好处，并在所有 AB 定量 PCR 仪上优化，以便实验人员充分利用Rox?参比染料所带来的好处。此外，所有AB 生产的 Real-TimePCR PCR 仪上优化，以便实验人员充分利用Rox?参比染料所带来的好处。此外，所有AB 生产的 Real-TimePCR 图 1：多组分图显示 Rox?信号和报告染料信号一同抬起，结果指示存在蒸发 Rox?提供强大的故障分析工具 Rox?参比染料作为故障分析工具的价值同样不应被低估。如果一个反应失败了，依靠Rox?参比染料确保在反应过程中有持续不变的信号标准十分重要。Rox?信号可以提供反应设置的信息提示：无Rox?信号，很明确地表明没有放置 MasterMix 试剂；异常大的信号值强度差异，提示可能放置了 2 倍反应体系；Rox?信号不规则变化，提示可能存在仪器故障。AB 公司的技术支持在故障排除工作中总会使用 Rox?参比染料，以帮助在更短时间内获得更多信息量的检测结果。 Rox?均一化反应体积差异 以下实验数据证明了 Rox?参比染料在校正移液误差所导致的反应间均方差上的价值，同时也证明 AB 定量 P CR 仪器在使用或不使用 Rox?参比染料都能获得很好的性能表现和精确性。 实验一：获得高精确性不一定需要 Rox? 从 AB RNase P Instrument verification Plate 中取出反应混合液，分别移液入对应的 Fast 96 孔板中。在 AB 7500 Fast Real-Time PCR 仪上运行这块板。数据分析分别采用 2 组模式，一组为正常的减去 Rox? 参比染料，另一组将参比染料设置成“None”，从而显示使用Rox?信号均一化处理数据的价值。技术重复(24 次重复)的结果显示，使用 Rox?和不使用 Rox?都得到了很好的结果。使用 Rox? 一组的 Ct 值 SD(标准偏差)，不使用 Rox? 一组的 Ct 值 SD(标准偏差)(见图 2)。 图 2：技术重复的扩增曲线，分别采用 Rox?校正(2A)和不采用 Rox?校正(2B)，显示重复的结果聚合紧密， 散布很小。 实验二：Rox?均一化处理校正移液错误 通过系统地减少从 RNase P Plate 中移出的样品，加入分子纯级水补齐体系，来模拟移液错误对运行精确性的影响。图 2 描绘了实验一中的原体积样本，以及 3 个移液错误重复：分别含, 和μl of ddH2O(样本体积相应减少)。数据分析时使用 Rox?参比染料校正初始浓度差异(由移液错误导致的)，得到的 Ct 值 SD(标准偏差)为；而不使用 Rox?参比染料校正的 Ct 值 SD(标准偏差)为(见图 3)。 图 3：技术重复与 3 重模拟样本移液错误(分别用,