SN_T 3752-2013苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3752--2013苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phacidiopycnis washingtonensis Xiao J.D Rogers2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3752—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王卫芳、冯黎霞、胡佳、章柱、华丽一 SN/T 3752—2013苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法范围1本标准规定了植物检疫中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境苹果和梨植株及其果实中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2455进出境水果检验检疫规程3检疫鉴定原理苹果星裂壳孢果腐病菌在寄主上的症状、病菌形态学特征与培养性状及分子生物学特征是制定本标准的主要依据。该病菌的分类地位、寄主范围、分布和为害症状等背景资料参见附录A。4仪器及用具4.1仪器体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、生物培养箱、台式高速离心机、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电子天平（感量0.01g）、水浴箱、pH计4.2用具样品袋、标签、放大镜、镊子、解剖方、酒精灯、接种针、培养Ⅲ（直径9cm）、烧杯、三角瓶、试管、量筒、载玻片、盖玻片、研钵及研杆、微量移液器（可调式范围：2.5小L～1000μL)、离心管。5试剂和培养基5.1试剂1%NaCIO溶液、无水乙醇、70%乙醇、无菌双蒸水、2%CTAB提取缓冲液、10%SDS溶液、3mol/L醋酸钠溶液、PCR试剂（包括Taq聚合酶、dNTP、Buffer）、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCI、EDTA、琼脂糖、DNA分子量标准、TBE电泳缓冲液。5.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：每1000mLPDA由200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配制而成。酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA）：每1000mLPDA中加人4.0mL25%乳酸。1 SN/T375220136检疫鉴定方法6.1口岸现场查验6.1.1抽样口岸现场查验时，按照SN/T2455进行抽样与取样。6.1.2枝条症状检查观察嫩枝顶梢是否枯死，树皮是否干枯，病部是否有突起细小的黑色颗粒状分生孢子器及乳黄色分生孢子团等病征（症状特点参见附录A、图B.1图片10～11）。6.1.3果实症状检查仔细检查果梗凹部、萼凹部是否腐烂，病部质地及颜色，病部是否有突起细小的黑色颗粒状分生孢子器及乳黄色分生孢子团等病征（症状特点参见附录A、图B.1图片1～9)。将可疑枝条和果实样品带回实验室作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。6.2实验室鉴定6.2.1直接检验观察记录病果的外观及剖面症状特点，将有明显病征的病枝与病果置于体视显微镜下检查，挑取病部黑色粒状分生孢子器制成玻片，置于生物显微镜下镜检。6.2.2保湿培养如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征，则将病枝（截成5cm）或病果置于样品袋中，于20℃下保湿培养，观察症状的变化。6.2.3分离培养直接挑取病部的分生孢子器或分生孢子团，置于APDA平板上；或采用组织分离培养法，用1%NaCIO溶液或70%乙醇对果实表面喷雾消毒，风干后用消毒过的刀片切取病健交界处果肉组织，切成5mmX5mm小块后放置于APDA中，在20℃、黑暗下培养7d～14d，定期观察，将菌落边缘菌丝体置于新鲜的APDA平板上进行纯化，以便用于后续的形态学和分子生物学鉴定。6.2.4病菌形态特征和培养性状观察显微镜检分生孢子器及分生孢子的形态特征、产孢方式。在20℃、黑暗条件下，观察记录菌落的生长速度、颜色变化、分生孢子器及分生孢子团的形成情况。6.2.5分子生物学鉴定DNA提取采用附录 C中的 CTAB法提取病菌基因组DNA。PCR检测及ITS基因分析采用C.1、C.2扩增检测病菌基因组DNA中的ITS基因，测序后采用C.3进行BLAST与系统发育2 SN/T 3752---2013分析。7鉴定特征7.1病菌形态在寄主果实上分生孢子器半埋生或几乎表生，亚球形，稍扁平，暗黑色，直径约0.3mm～0.8mm，单腔室或多腔室，开口单个或几个，呈小孔状或不规则孔穴。产孢方式为瓶梗式内壁芽生或合轴式全壁芽生，分生孢子无色透明，单胞，泪滴形、一端平截，或卵形至椭圆形，无胞痕，光滑