微生物实验二-产淀粉酶细菌的筛选和选育实验论文.docxVIP

微生物实验论文 PAGE4 / NUMPAGES5 产淀粉酶细菌的筛选和选育 陆 芸 （南京师范大学生命科学学院 09级3班 【摘要】分子特征的鉴定主要以16SrDNA 序列分析的方式进行，16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定。 【关键词】产淀粉细菌，分离，筛选，紫外诱变 土壤是微生物的大本营，微生物资源的寻找和筛选工作常将土壤作为样品采集的首选地。本实验采集了南京师范大学北去食堂后的土壤样本，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及诱变育种等过程，旨在发掘利用微生物资源，筛选并选育产淀粉酶细菌。 　　土壤微生物种类繁多，对于采集培养的细菌通常进行生物学鉴定。除通常用的形态学方法外，分子特征的鉴定主要以16SrDNA 序列分析的方式进行，16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定。 　　紫外线是最常用的一种物理诱变因素，对诱变最有效的波长是在253-265nm。紫外线具有致死和诱变的双重效应。紫外线照射引起的DNA损伤，可由细胞内的光复活酶的作用进行修复。因此用紫外线照射处理时以及处理后的操作应该在红光下进行，并且将照射处理后的微生物置于暗处培养。 一、实验材料与方法 １．实验仪器和材料 仪器：全自动高压蒸汽灭菌釜，手提式高压蒸汽灭菌釜，电子台秤，普通天平，无菌离心管，摇床，分光光度计，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，PCR管，PCR仪，微量移液枪，枪头，超净工作台，脱色摇床，台式高速离心机 试剂：摇瓶发酵培养基相关的化学药品、试剂与原料、1N的NaOH和HCl， 配制牛肉膏蛋白胨培养基，革兰氏染色全套试剂， PCR反应试剂，琼脂糖，溴化乙锭，TAE电泳缓冲液 ２．实验步骤 　　2.1 培养基配制 2.1.1牛肉膏蛋白胨培养基的配制 配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，pH7.0～7.2 2.1.2无菌水的准备 2.1.3 灭菌材料与器皿的包扎 2.2 土壤样品的采集并制备土壤稀释液 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，即为稀释10-1的土壤悬液。然后在离心管中依次稀释至10－2 、10－3 稀释度。 2.3 制备淀粉培养基、平板并涂布、划线平板分离、培养鉴定 2.3.1制5块含1%可溶性淀粉的牛膏蛋胨培养基平板 2.3.2涂布平板分离、划线平板分离 无菌操作法分别吸取0.1 mL 10－2 、10－3土壤稀释液及80℃加热的10－2 的土壤悬液，分别加在已制好的淀粉平板培养基上,将稀释液在培养机上充分混匀铺平， 取10－1 的土壤悬液在平板上划线。30℃恒温箱培养，培养24小时。 2.3.3鉴定 先将单个菌落用记号笔标号，将标记的单菌落用灭菌牙签划线接种到另一新鲜平板上，记下相应标号，30℃培养备用。然后打开平板，倾斜倒入碘液，快速放平，5分 钟后观察显色斑点，观察产水解斑的菌落并记录水解斑的大小。 2.4　产淀粉酶细菌培养 　　　　对照分离平板上菌落的水解圈大小，挑取水解圈最大一个菌苔，在淀粉培养基平板上进行划线分离，进一步纯化菌株 　 2.5　不同营养和培养条件 2.5.1菌种活化与培养 提前24h平板菌种接液体试管活化，并接种一支斜面试管保藏 2.5.2发酵液接种 提前3h按0.5％接种量分别转接如下五种液体摇瓶发酵培养基。 2.5.3菌体生长量的测定 将培养18h后液体摇瓶培养物分别取出3mL于比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(optical density，OD600值)。 分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。 2.6　产淀粉酶待检菌形态特征鉴定 培养特征的观察、细菌细胞的显微观察、细菌的革兰氏染色 2.7　细菌的16S rRNA分子鉴定 用灭菌牙签挑取单菌落于20 ul PCR管中，加热10min,离心2min。在一个PCR管中用微量移液枪加入混合液20ul，和5 ul菌液,置于冰上备用。震荡，将菌体和反应体