免疫学检测技术的基本原理演示文稿.pptVIP

抗原肽-MHC四聚体分离技术 亲和素 抗原肽 MHC I 生物素 anti-CD8 肽-四聚体 肽特异性CD8T CD4T及B 非肽特异性CD8T 荧光素 当前第31页\共有43页\编于星期三\20点 免疫学检测技术的基本原理演示文稿 当前第1页\共有43页\编于星期三\20点 第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 第二节 免疫细胞检测 第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用 本章内容 当前第2页\共有43页\编于星期三\20点 第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 一、抗原抗体反应概念 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。 当前第3页\共有43页\编于星期三\20点 二、抗原抗体反应的特点 高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。 表示为 亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原结合位点间的结合能力。 亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子间的结合强度，与抗原表位数目有关。 当前第4页\共有43页\编于星期三\20点 2.抗原抗体结合的带现象与可见性 抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例（等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应； 当前第5页\共有43页\编于星期三\20点 3. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。 抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。 当前第6页\共有43页\编于星期三\20点 三、抗原抗体反应的影响因素 电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合； 温度 通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活； 酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。 当前第7页\共有43页\编于星期三\20点 四、抗原抗体反应检测技术的应用 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。 当前第8页\共有43页\编于星期三\20点 五、抗原-抗体反应的基本检测方法 当前第9页\共有43页\编于星期三\20点 Ab Ag 高亲和力 Ab Ag 低亲和力 特异性 结合力的表示方法 亲和力和亲合力 低亲合力 高亲合力 Ag-Ab反应的原理 当前第10页\共有43页\编于星期三\20点 Ab 过剩 Ag 过剩 比例适当，交联成网络 Ag-Ab反应的可见性 当前第11页\共有43页\编于星期三\20点 1.凝集反应 直接凝集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。 玻片法 试管法 常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定 选择最佳稀释浓度，常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。 当前第12页\共有43页\编于星期三\20点 间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断： + Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 病人的RBC 体内anti-Rh 由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集 + Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 体外加入抗人IgG 出现凝集现象，叫直接库姆试验 正常人O型血的Rh+的RBC + Y Y Y Y 患者血清内的游离anti-