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双酚a对微小小环藻的急性毒性效应 双酚a（bipsiea）的学名是氨基二苯基丙烯酸酯（c15h16a2）。这是生产环氧树脂（ep）树脂、酚醛树脂、可塑性聚吡咯烷、抗氧剂和氯氯醚（pvc）稳定性的前体材料。广泛应用于会计核算行业，如包装甲、袋装甲、牙科填充剂、婴儿瓶等。双酚A具有雌激素活性,可干扰人体内分泌系统。美国环境保护局1997年公布的内分泌干扰物名单中双酚A被列为可疑内分泌干扰物。1998年日本在河川、湖泊、地下水及封闭性海域等调查地点检出频率较高的内分泌干扰物质中就包括双酚A。当水体中双酚A浓度达到1 μg/L,即可引起腹足类Nucella lapillus雄性个体雌性化。 随着工业和经济的发展,双酚A的生产和使用大量增加,全球双酚A使用量已超过200万t,其最终归宿是由各种途径进入水体,并可通过食物链作用在水生生态系统中进行传递,对水生生物产生内分泌干扰作用。目前,国内外双酚A对水生生物的毒理和毒性作用研究不多。深圳湾福田红树林保护区是我国国家级自然保护区,生物多样性十分丰富,但其水域中双酚A含量已达对水生生物有所影响的浓度。本文通过研究双酚A对红树林优势藻种的生态毒理效应,来了解双酚A对红树林水生生物的潜在危害。 1 材料和方法 1.1 实验仪器及设备 双酚A购自美国Sigma-Aldrich公司,以甲醇为溶剂配成10 000 mg/L的母液,实验时再以甲醇稀释成所需浓度。 实验中所用仪器有显微镜(OLYMPUS CX31)、制冰机(SCOTSMAN AF100)、分光光度计(HITACHI U-1800)、高速离心机(Anke TGL-16G)、数码相机(NIKON COOLPLAX4500)、MGC-300B型光照培养箱、WSZ-200A型摇床、XW-80A型旋涡混合器、血球计数板、高压灭菌锅、三角瓶等。 1.2 藻种的生长caspia 从福田红树林近岸水域中分离纯化优势藻种微小小环藻(Cyclotella caspia),在无菌条件下以人工海水配制的f/2培养基于光照培养箱中培养作为本研究实验藻种。培养条件为:温度26 ℃;光强4 000 lx,光暗比12h∶12h。藻细胞初始接种密度为1.32×104个/mL。 1.3 海藻密度的测定 移取0.1 mL藻液于血球计数板上,在100倍显微镜下进行计数。 1.4 不可见效应浓度 以不同浓度甲醇处理微小小环藻,96 h后在显微镜下计数。与对照组无显著性差异的最高浓度可定为甲醇的不可见效应浓度(no observed effect concentration, NOEC)。 1.5 生长抑制率测定 根据生长速率μ公式计算藻细胞生长速率,根据Iμi公式计算生长抑制率。将双酚A浓度与生长抑制率进行一元线性回归,得到双酚A对微小小环藻的半效应浓度(EC50)。 1.6 测定了蓝色信号的含量 采用ISO10260乙醇提取法进行叶绿素a含量测定。 1.7 内膜系统结构的破坏 逆境胁迫下生物体内O2-·、H2O2、·OH等活性氧会大量增加,它可引起质膜和内膜系统结构的破坏和功能的丧失,甚至导致细胞的死亡。生物体在长期进化过程中发展了抗氧化防御系统,SOD是抗氧化防御系统中清除超氧阴离子自由基(O??22-?)的关键酶,SOD活性可作为解释生物对逆境胁迫耐受力和污染物对生物致毒机理的指标。 (1) 粗酶溶液的制备 离心法收集藻细胞,加入磷酸缓冲液和少量石英砂在冰浴中研磨,匀浆液冷冻离心,上清液即为粗酶提取液。 (2) 可溶性固形物含量的测定 采用考马斯亮蓝法测定,以小牛血清蛋白作标准曲线。 (3) 氮蓝四唑nbt的光化学还原反应法 采用Beauchamp建立,Bewley等改进的氮蓝四唑(NBT)光化学还原反应法测定,以单位时间内NBT还原反应速度被SOD抑制50%所需酶量为一个酶活力单位(u·mg-1·min-1)。 1.8 细胞形态的观察 显微镜(400×)下观察藻细胞形态的变化,用测微尺测量藻细胞环面与壳面的尺寸,并进行显微拍照记录藻在各浓度双酚A作用下的形态变化。 2 结果与讨论 2.1 小环藻的急性毒性实验 通过实验得到甲醇NOEC值为0.5%,双酚A 96h-EC50值为8.30 mg/L。以96h-EC50值为中心浓度,设4,6,8,10和12 mg/L双酚A进行微小小环藻急性毒性实验。微小小环藻的生长曲线见图1。由图1可以看出,双酚A对藻细胞生长产生不同程度的抑制作用,且抑制程度与双酚A浓度显示出明显的剂量-效应相关性。4~6 mg/L双酚A使藻细胞增长较对照组缓慢,生长周期延长;8~10 mg/L双酚A对藻细胞生长产生明显抑制作用,并使其生长周期缩短;当双酚A浓度高于10 mg/L时,藻细胞几乎停止生长。 2.2 藻细胞密度和叶绿素a含量的变化 如图2所示,随