地中海贫血的诊断方法.docxVIP

地中海贫血的诊疗方法 B-地中海贫血的筛查和诊疗主要依靠实验室检查，方法主要 有： 血惯例检测 地中海贫血的重要特点之一是小细胞低色生性贫血，如MCV≤ 80fl，MCH≤25．0Pg，则可疑为地中海贫血患者或基因携带者， 可同时测定血清铁和铁蛋白，以清除缺铁性贫血。 2红细胞浸透脆性试验(一管法) 其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗拙、凹陷、折叠和浆膜扩 展，膜与内容物之比增大，对浸透溶解的抗性增添，在0．32％(或 0．36％)NaC1中溶解度降低(脆性降低)。一管法可用于地中海贫血 集体筛查。 血红蛋白(Hb)电泳Hb电泳 是检测地中海贫血、异样血红蛋白最常用的方法，可察看到 HbE、HbH等异样血红蛋白区带，同时可定量检测HbF、HbA2的含量并 划分常有种类的地中海贫血。有研究显示MCV、Hb电泳和红细胞脆性 实验三者联合检测的敏捷度可达100％，阴性预告值达100％，联 合特异度可达100％，阳性预告值达100％DS。 4高效液相色谱技术(HPLC) 原理：采纳微柱法离子互换层析和梯度洗脱技术，全自动分 析仪可分别血红蛋白的变异体与亚型，简单发现重型和轻型B地中海 贫血。在操作上，HPLC采纳的是全血标本，不需要制备Hb液，只需 将全血标本直接放在仪器上，经过电脑操作便能实现HbA、HbA2、 HbF等定量检测。长处：所需样本量少，自动化程度高，操作简单， 迅速，能除去人为偏差，结果正确。HPLC也可用于胎儿脐带血的产 前诊疗，可诊疗出重型B地中海贫血，但不可以划分正常胎儿和杂合子 胎儿。最近几年来，地中海贫血高发地域也采纳此法进行携带者检 测。 基因诊疗 最近几年来，跟着分子生物学研究领域的不停发展，从最先的B珠蛋 白基因簇限制性酶切多态性检测至当前的聚合酶链反响(PCR)技术结 合其余分子生物学方法，B地中海贫血的诊疗已逐渐改良和完美。基 因诊疗方法有以下几种： 5．1限制性片段长度多态性连锁剖析(RFLP连锁剖析) 原理：DNA限制性内切酶可辨别并切割DNA上特定的核苷酸序列，得 到必定长度的DNA片段，而碱基的突变可致使酶切位点的丢掉或形 成，进而改变酶切片段的大小。突变基因在经过相应的限制性内切 酶水解后，其电泳条带的数目和大小就会发生改变，依据这些改变 可判断出突变能否存在。弊端：因为独自使用该方法，不可以直接测 出受试者突变基因的种类，一定联合寡核苷酸探针等技术，故其应 用范围有必定限制，且操作繁琐。假如母亲或父亲在全部的多态性 位点上都为纯合子，没法用此方法进行产前诊疗，或许患儿和父亲母亲 全部位点上都是杂合状态，只好进行50％的清除性诊疗。 5．2探针斑点杂交技术(allele—specificoligonucleotide ASO)应用引物扩增珠蛋白基因，同时合成与正常序列和突变 序列完整互补的寡核苷酸探针。将PCR扩增产物点在尼龙膜上，分别 与标志的正常和突变的ASO探针杂交，不完整互补的探针，在必定条 件下能够完整洗脱，再从放射自显影察看杂交结果。假如两个等位B 珠蛋白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅 与突变探针杂交。这类检测方法迅速、敏捷。弊端：对DNA的纯度和 数目要求较高，一次杂交能检测一种突变，关于拥有高度异质性的B 地中海贫血常常需要多次改换探针杂交，才能确立诊疗，如使用同 位素标志探针，还存在放射性污染等问题。 5．3反向点杂交方法(Reversedotblothybridization，RDB) 与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基来源理同样，所不 同的是：将膜上固定探针代替固定靶DNA，经一次杂交即可对未知样 品中多个突变进行检测，改变了传统杂交法一次只好检测一种突变 的方式。长处：较迅速、敏感，操作简单。弊端：只好检测已知位 点突变的B地中海贫血，不可以检出未知突变。 5．4缺口PCR(gapPCR)原理：设计三个或两对引物，即在 缺失地区外侧，凑近缺失位点的地点设计一对引物，此外一个或一 对引物在缺失地区内。在缺失地区内的引物能够在杂合子和正常人 中扩增出片段，在缺失纯合子中不可以扩增。在缺失地区外侧的一对 引物，因为缺失使相距甚远的两头DNA拉进，进而可扩增出特定的 DNA片断。进而检测出纯合子患者，杂合子携带者。Wang等报导用 此方法对89个B珠蛋白基因突变的检测。 5．5扩增不该突变系统(amplificationrefractorymutation sys—tems，ARMS)或称等位基因特异性PCR原理：在PCR中，针 对某个点突变设计出3端碱基与目的基因的突变碱基互补的引物， PCR反响中，只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因则 不可以扩增。进而将正常与突变的DNA差异开来。长处：仅需微量的 DNA样品(100～400ng