DB35T 1327-2013番鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS 07.080 B41 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1327—2013 番鸭呼肠孤病毒 RT-PCR 检测方法 2013 - 02 - 20 发布 2013 - 05 - 20 实施 福建省质量技术监督局 发 布 I DB35/T 1327—2013 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 方法原理 1 4 实验室准备 1 5 实验室条件 2 6 操作程序 2 7 分析判定 2 8 样品无害化处理 3 附录 A(规范性附录) 试剂的配制 4 附录 B(资料性附录) 番鸭呼肠孤病毒 S1 基因序列 6 参考文献 7 II DB35/T 1327—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准由福建省农业科学院畜牧兽医研究所负责起草。 本标准主要起草人： 林锋强， 陈少莺， 胡奇林， 陈仕龙， 王劭， 程晓霞， 朱小丽， 李兆龙， 黄冬菊， 陈建翊。 1 DB35/T 1327—2013 番鸭呼肠孤病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了应用 RT-PCR 方法检测番鸭呼肠孤病毒的材料准备、操作方法、结果判定及样品无害 化处理。 本标准适用于番鸭呼肠孤病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 将番鸭呼肠孤病毒RNA基因逆转录为互补DNA，以此为模板，利用番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus， MDRV) S1基因序列(见附录B) 设计的一对引物,进行PCR特异性扩增， 扩增与预期大小300bp 相符的片段，对病毒核酸进行定性。 4 实验室准备 4.1 微量移液器 4.2 高速冷冻离心机 4.3 聚合酶链式反应仪 4.4 电泳仪 4.5 凝胶成像系统 4.6 PBS(0.01mol/L pH7.2) 配制方法按附录 A 中 A.2 进行。 4.7 TRIzol 试剂 4.8 三氯甲烷(分析纯) 4.9 异丙醇(分析纯) 4.10 无水乙醇(分析纯) 4.11 50×TAE 缓冲液 配制方法按附录 A 中 A.3 进行。 2 DB35/T 1327—2013 4.12 电泳级琼脂糖 配制方法按附录 A 中 A.4 进行。 4.13 AMV 反转录酶 4.14 RNA 酶抑制剂 4.15 Taq DNA 聚合酶 4.16 SYBR 荧光染料 配制方法按附录 A 中 A.5 进行。 4.17 上样缓冲液 配制方法按附录 A 中 A.6 进行。 4.18 灭菌双蒸馏水 配制方法按附录 A 中 A.7 进行。 4.19 MgCl2 溶液 4.20 5×反转录反应缓冲液 配制方法按附录 A 中 A.8 进行。 4.21 Random 9mers 配制方法按附录 A 中 A.9 进行。 4.22 2.5mmoL dNTPs 配制方法按附录 A 中 A.10 进行。 4.23 10×PCR Buffer 配制方法按附录 A 中 A.11 进行。 4.24 引物 配制方法按附录 A 中 A.12 进行。 4.25 DNA 分子量标准(DL2000) 4.26 MDRV 细胞毒 配制方法按附录 A 中 A.13 进行。 注：建议使用经验证有效的商品化核酸提取、反转录、聚合酶链式反应试剂盒，配合本标准开展 RT-PCR 检测。 5 实验室条件 RT-PCR 实验室应划分出 RNA 提取区、基因扩增区、电泳区。 6 操作程序 6.1 样品的采集和处理 无菌采集病鸭或病鹅的样品(肝、脾、血液、分泌物或排泄物等)，加无菌 PBS (0.01mol/L pH7.2) 制成 10％悬液，冻融 3 次， 3000 g 离心 20min，取上清液，待提取 RNA 。1) 1) 检测后的样品应进行高压消毒无害化处理。 3 DB35/T 1327—2013 6.2 实验对照 设立阳性对照、阴性对照。 6.3 RNA 的提取 每个样品取250μL上清液加入750μLTRIzol试剂， 反复摇匀； 室温(15℃~30℃) 放置5min； 加入 150μL氯仿， 剧烈振荡15s，室温放置3 min；2℃~8℃10000 g离心