DB35T 1995-2021禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术.docxVIP

ICS 11.220 CCS B 41 福 建 省 地 35 方 标 准 DB35/T 1995—2021 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断 技术 Fluorescence quantitative PCR diagnosis of fowl hydropercardium-hepatitis syndrome 2021 - 08 - 17 发布 2021 - 11 - 17 实施 福建省市场监督管理局 发 布 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 疫病概述 1 5 设备、材料和试剂 2 6 样品的采集、保存和处理 2 7 样品中病毒 DNA 提取 3 8 荧光定量 PCR 操作步骤 3 9 结果判定 3 10 测序 4 附录 A (规范性) 试剂的配制及引物序列 5 附录 B (资料性) 扩增产物参考基因序列和荧光定量 PCR 扩增曲线图 6 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分： 标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心。 本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、 万春和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术 1 范围 本文件规定了禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术的设备、材料和试剂，样品的采集、处 理和保存， 样品中病毒DNA的提取，荧光定量PCR操作步骤及结果判定的技术要求。 本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流行病学监测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽心包积液-肝炎综合征 fowl hydropercardium-hepatitis syndrome；HHS 由禽腺病毒4型引起禽类的以心包积液、肝炎为特点的一种综合征。 3.2 禽腺病毒 4 型 fowl adenovirus serotype 4；FAdV-4 引起禽心包积液-肝炎综合征的病原。 3.3 循环阈值 cycle threshold；Ct 值 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 疫病概述 禽心包积液-肝炎综合征 (HHS) ，最早于1987年发生于巴基斯坦安卡拉地区。目前， 该病呈现世界 范围分布， 多个国家、地区相继报道该病的发生， 各地分离到的毒株略有差异，但大多为FAdV-4，且具 有很强的致病性。 2010年以来，我国多地发生了HHS，并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特 征为心包充盈，心包内积有淡黄色液体或胶冻样物；肝脏呈现不同程度肿胀， 质地较脆、易碎， 有出血 斑或出血点；肾脏肿大、质地较脆， 有的呈现“花斑肾”。该病主要发生于3~5周龄肉鸡，10~20周龄 蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4 d后开始死亡， 死亡期可持续7 d~ 10 d，发病率和病死率分别为10%~30%和20%~75%。该病一年四季均可发生， 以水平传播为主， 也可垂 直传播，感染鸡排毒期可长达9周，发病日龄越早，死淘率越高。 5 设备、材料和试剂 5.1 设备 5.1.1 台式冷冻高速离心机(转速应＞12 000 r/min)。 5.1.2 水浴锅或金属浴。 5.1.3 微量可调移液器(量程分别为 100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、2 μL~20 μL、0.5 μL~ 10 μL)。 5.1.4 荧光定量 PCR 仪。 5.1.5 旋涡混合仪 5.2 材料和试剂 5.2.1 棉拭子稀释液： 配比按照附录 A 的 A.1。 5.2.2 组织稀释液：配比按照附录 A 的 A.2。 5.2.3 10% SDS 溶液：配比按照附录 A 的 A.3。 5.2.4 3 mol/L 醋酸钠缓冲液(pH5.2)： 配比按照附录 A 的 A.4。 5.2.5 75%乙醇：配比按照附录 A 的 A.5。 5.2.6 荧光定量 PCR 检测用引物和探针的序列、使用方法：配比按照附录 A 的 A.6。 5.2.7 蛋白酶 K、Tris 饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇(25:2