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放射毛霉胞外和胞内蛋白酶的研究 结果表明，在早期阶段，由酪氨酸酶（主要是内醇酶）产生的细胞外部酶（主要是内醇酶）的水解作用。随着发酵，细菌体溶解并释放细胞内酶。由于细胞内酶主要是氨基酸和氨基酸酶，因此喂食的发展主要是在发酵的后期，即细菌体溶解后，即含有不同细胞表面的细菌——细胞内外和内酶在酪氨酸酶中的作用。hwalwalwalwalwalwalwalwal组、布雷西泮（m.praini）和梨毛菌（m263-3）的脱丝酶（m）。结果表明，这些细胞酶主要结合在丝表面的细胞表面的异质醇酶，而对细胞醇是否存在于异质醇是否存在的研究还不够。《退耕地生物化学》是中国传统腐殖剂中常见的优良菌株之一。关于酶的科学研究主要集中在细胞表面的生产条件和特性上。为了更好地开发一种优雅的辐射促生素酶，作者利用超声粉碎、蛋白质电泳和高压液相层析成像（hplc）等技术对优雅的市场经济中的同胞和内源性丙烯酸进行了比较。 1 材料和方法 1.1 豆腐坯、试剂和仪器 菌种:雅致放射毛霉(Actinomucor elegansAS3.227),由北京王致和腐乳厂提供;豆腐坯:由北京王致和腐乳厂提供,切成2.5 cm×2.5 cm×2.4 cm的方块;试剂:所用Tris,TEMED,β-巯基乙醇,Tricine,SDS,尿素,甘油,过硫酸铵,丙稀酰胺,N,N’-甲叉双丙稀酰胺等电泳试剂,乙腈,三氟乙酸等色谱试剂均购于北京试剂公司;大豆分离蛋白为日本不二制油提供. 1.2 冻离心防冻 JY92-Ⅱ超声波细胞破碎机:上海新芝生物技术研究所制造;GL-20B冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂生产;ECP3000三恒电泳仪及垂直式小型电泳槽:北京六一仪器公司产品;Agilent 1100高压液相色谱仪:ODS柱(250 mm×4.6 mm),二极管阵列检测器,Agilent公司产品. 1.3 方法 1.3.1 蛋白酶的附着 将4 ℃保存的菌种在PDA斜面培养基上活化、培养后,加入灭菌后的蒸馏水,震荡1 min,制取孢子悬浮液,接在豆腐坯表面,25 ℃下培养48 h,凉花后,得到腐乳毛坯,蛋白酶即附着在毛坯表面菌丝上. 1.3.2 提取外来和内侧酶 1 胞外蛋白酶粗液的提取 剥取毛坯表面菌丝,加入10倍重量0.3 mol/L的NaCl溶液,4 ℃冰箱中过夜提取,4 ℃下冷冻离心(10 000g),上清液即为胞外蛋白酶粗液. 2 胞内及胞内蛋白酶的提取和纯化 将上述离心后的沉淀,用0.3 mol/L的NaCl溶液反复清洗以除去残留的胞外酶,压滤后,加入与胞外蛋白酶制备时同样质量的0.3 mol/L的NaCl溶液,冰浴中超声波破碎(800 W,15 min,每次4 s,间隔4 s),4 ℃冰箱中过夜提取,4 ℃下冷冻离心(10 000g),上清液即为胞内蛋白酶粗液. 在上述蛋白酶提取液中加入硫酸铵,收集30~70%饱和度,4 ℃过夜沉淀部分,冷冻离心(10 000g)后,用少量缓冲溶液溶解,4 ℃下透析脱盐、聚乙二醇浓缩,得到胞外及胞内蛋白酶. 1.3.3 表面活性剂的制备 以质量分数2% 2 mL的大豆分离蛋白为底物,分别用2 mL胞外蛋白酶和胞内蛋白酶水解(40 ℃)2 h,用4 mL 4 mol/L的三氯乙酸终止反应,静置10 min后过滤,滤液即为胞外和胞内蛋白酶的水解液.空白液为4 mL 4 mol/L的三氯乙酸先与2 mL的酶液作用后,再加入2 mL的底物溶液,其余操作相同.所有水解液及空白液均经过0.45 μm滤膜过滤. 1.3.4 sds-东南角凝胶电泳 对胞外及胞内蛋白酶提取液分别进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)和添加底物明胶的底物凝胶电泳(Gel),分离胶质量浓度为12.5 g/dL,浓缩胶质量浓度为3 g/dL,30 mA稳流,上样量为20 μL.Gel不连续凝胶电泳在4 ℃下进行. SDS电泳为考马斯亮兰R-250染色,体积分数30%甲醇脱色;Gel电泳结束后,用含Triton X-100(5%),pH 7.5的磷酸缓冲液漂洗后放入pH 7.5磷酸缓冲液中,在37 ℃下过夜反应后,再氨基黑染色、蒸馏水脱色. 1.3.5 溶剂b为体积分数的乙腈乙酸洗脱条件 进样量:10 μL;检测波长:214 nm;洗脱液:溶剂A为水(含体积分数0.1%的三氟乙酸);溶剂B为体积分数40%的乙腈水溶液(含体积分数0.08%的三氟乙酸);洗脱条件:梯度洗脱.溶剂B体积分数从10~40%,体积流量为0.7 mL/min,14 min;从体积分数40~60%,体积流量0.5 mL/min,40 min;从体积分数60~90%,体积流量0.7 mL/min,10 min. 2 结果与讨论 2.1 培菌对蛋白质活力的影响 前期培菌时,毛霉胞外及胞内蛋白酶(粗酶液中)活力