子生物学研究方法(上)——生物大分子操作技术.pptVIP

南京农业大学 生命科学学院分 子 生 物 学 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院2第五章 分子生物学研究法〔上〕——DNA、RNA及蛋白质操作技术2023/8/242南京农业大学 生命科学学院 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院3第五章 分子生物学研究法〔上〕2023/8/243南京农业大学 生命科学学院 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速开展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院4第五章 分子生物学研究法〔上〕2023/8/244南京农业大学 生命科学学院基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一局部，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院5第五章 分子生物学研究法〔上〕内容：重组DNA技术回忆DNA根本操作技术RNA根本操作技术基因克隆技术蛋白质组与蛋白质组学技术2023/8/245南京农业大学 生命科学学院 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院6第一节 重组DNA技术回忆2023/8/246南京农业大学 生命科学学院三大成就40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质根底问题；50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保存复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法那么〞和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院92023/8/24南京农业大学 生命科学学院91982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983?获得第一例转基因植物。1984?斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986?GMO首次在环境中释放。1988?J. D. Watson出任人类基因组计划首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--Oncomouse。1992?欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2005中、美、日科学家联合完成基因组全序列测定。 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院10第一节 重组DNA技术回忆重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。早在1967年，世界上有5家实验室几乎同时报道了DNA连接酶。2023/8/2410南京农业大学 生命科学学院 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院11 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院12 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a. DNA的粘性末端；b. DNA的平末端； c. 化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。 2023/8/24南京农业大学 生命科学学院13第一节 重组DNA技术回忆仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖2023/8/2413南京农业大学 生命科学学院 2023/8/24南京农业大学 生命科学学