酸枣仁汤对快动眼睡眠剥夺老年大鼠下丘脑室旁核信号通路的影响.docxVIP

酸枣仁汤对快动眼睡眠剥夺老年大鼠下丘脑室旁核信号通路的影响 酸枣仁汤是“缺钱”的总结。它由酸枣仁、椰子、知母、川药、甘草等苦味药物组成。不同的药物一起促进血液循环，消除淤血，消除不适。临床主治由肝血不足, 阴虚内热引起的虚烦不眠证。现代研究表明, 该方具有镇静催眠、抗焦虑、抗应激、改善睡眠时相结构等作用。课题前期研究通过促眠实验以及Morris水迷宫检测学习记忆实验, 证实了酸枣仁汤的镇静催眠及改善学习记忆能力作用, 并与脑内氨基酸类神经递质的调节密切相关。为进一步探索酸枣仁汤改善睡眠质量及脑保护的作用机制, 本课题拟检测氨基酸类神经递质γ-氨基丁酸 (GABA) 的B型受体GAB-AB1R介导下丘脑室旁核 (PVN) 腺苷酸环化酶-环腺苷酸-蛋白激酶A-c AM P反应元件结合蛋白 (AC-c AMP-PKA-CREB) 学习记忆信号转导通路中的GABAB1R、c AMP和CREB等的表达和变化, 探讨酸枣仁汤对老年失眠的作用机制。 1 药物、动物及单次给药 1.1实验动物自然老年健康24月龄Wistar大鼠, 雌雄各半, 140只, 体重500~600 g, 由湖北省实验动物研究中心提前订购提供, 许可证号SCXK (鄂) 2008-0005。 1.2药物与试剂酸枣仁汤由酸枣仁30 g、知母12 g、茯苓12 g、川芎12 g、甘草6 g组成。全部药材购自湖北中医药大学附属医院药房, 常规方法 (以上方药加5倍于药材的温水, 浸泡30 min后微火煎煮15 min、文火煎20 min, 滤出药渣, 分别将药液浓缩成每毫升含生药0.648、1.296 g/L药液) 煎煮后经水提制成浓度为64.8%、129.6%, 分装灭菌后4℃保存备用。分别按12.96、25.92 g/ (kg·d) 剂量 (按体表面积系数换算, 分别为人体临床等效剂量的2倍和4倍) 给药。舒乐安定片, 山西亨瑞达制药有限公司生产, 批号111203。戊巴比妥钠, 北京化学试剂公司;多聚甲醛, 北京化学试剂公司;3-3二氨基联苯胺 (DAB) 显色试剂盒, 北京中山生物技术有限公司;30%H2O2, 北京化学试剂公司;0.01M PBS, 2000 m L/袋 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;甲醇 (北京化学试剂公司) ;正常山羊血清 (工作液, 北京中杉金桥生物技术有限公司) ;5%牛血清白蛋白 (BSA, 北京中杉金桥生物技术有限公司) ;GABA_B1抗体 (lioworld公司) ;GABABR1抗体 (lioworld公司) ;兔ABC Kit (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;GENMED染色液C、H-E STAIN-ING Kit (GENM ED公司, 美国) ;多克隆P-CREB Ser133抗体购于Cell Signaling Biotechnology。酶联免疫法 (EIA) 检测c AM P试剂盒购于Cayman Chemical。c AM P和孔雀石绿购于Sigma。SP免疫组化试剂盒 (含羊抗兔二抗) 和DAB显色剂 (北京中山生物技术公司) 。 1.3仪器与设备睡眠剥夺箱 (自制) , 为长72 cm、宽48 cm、高30 cm的鼠箱, 内置6个直径为8 cm, 高8 cm的平台, 平台间隔16 cm, 平台与鼠箱箱体壁间隔8 cm, 在平台周边注满水, 水面距平台面约1.0 cm, 大鼠在平台上可自行饮食饮水, 并可在不同平台上自由活动, 于箱体上放平行的不锈钢丝笼罩, 上面放水和食物;环境对照箱 (自制) , 与睡眠剥夺箱相似, 但在距其底部8.0 cm处不放置平台, 而是放置一面细密铁丝网, 大鼠在网上可自由活动, 其他条件均与睡眠剥夺组相同, 以形成与睡眠剥夺组相似的环境;恒温冷冻切片机 (Leica, 德国) ;显微镜 (Nikon, 日本) 。 1.4动物分组及给药将自然老年24月龄Wistar大鼠50只 (雌雄各半) , 随机分成5组, 每组10只:空白对照组、老年REM睡眠剥夺组、舒乐安定组 (阳性对照组) 、酸枣仁汤低、高剂量组。酸枣仁汤由酸枣仁30 g、知母12 g、茯苓12g、川芎12 g、甘草6 g组成。舒乐安定组大鼠按0.18 mg/ (kg·d) 给药, 酸枣仁汤低、高剂量组分别按12.96、25.92 g/ (kg·d) 给药, 给药容量均为2 m L/100 g。1次/d, 连续2周。空白对照组、老年REM睡眠剥夺组均灌服等容积生理盐水。 1.5老年REM睡眠剥夺大鼠模型的制备及给药对模型组大鼠采用改良多平台水环境法, 放置于自制的睡眠剥夺箱进行REM睡眠剥夺48 h。空白对照组则放置于环境对照箱中。 1.6大鼠脑内PVN部位GABAB1R阳性反应物谷氨酸受体NMDANR1检测将大鼠用多