静电纺壳聚糖纤维蛋白复合纳米纤维的制备及其细胞相容性.docxVIP

静电纺壳聚糖纤维蛋白复合纳米纤维的制备及其细胞相容性 0 壳聚糖与胶原蛋白复合材料 如何构建符合自然特征的组织工程支撑材料，以及利用csm为种子细胞提供良好的生长、殖长和功能表达环境一直是组织工程和再生医学的热点。静电纺丝技术最早由Formhals等在1934年实现。区别于传统纺丝,静电纺是一种使带电荷的聚合物溶液或熔体在静电场中射流来制备聚合物纳米级纤维的加工方法。以此技术制备的纳米纤维支架,具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构,相对于传统技术制备的材料支架能够更好地模拟天然细胞外基质的结构特点,为种子细胞的生长提供良好的微环境,在组织再生与修复领域具有相当广阔的应用前景。 壳聚糖是一种结构与细胞外基质中的主要成分糖胺聚糖(GAGs)十分类似的优良天然生物材料,也是现今所发现的惟一具有明显碱性、带有正电荷的天然多糖。壳聚糖成膜性好,机械强度高,具有良好的生物可降解性、生物相容性以及可利用的活性基团,使其在组织工程中得到广泛的应用。由于单纯的壳聚糖亲水性较差、降解速率慢等原因,需要对其改性或与其他材料复合来加以改善。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质,具有低抗原性、可被人体吸收、体内降解产物无毒副作用的优点,在作为生物材料方面的应用受到广泛关注。然而作为一种天然高分子,其机械性能不佳,特别是在水溶液中的降解速度太快,从而限制了它的应用。因此,采用静电纺丝技术将壳聚糖与胶原蛋白共混,将两者的优势结合起来以实现性能互补,在结构和功能上仿生细胞外基质。有关壳聚糖/胶原蛋白复合材料作为生物细胞外基质的潜在用途已经为许多研究工作者所认识。本实验通过静电纺丝技术制备壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维,体外接种猪髋动脉内皮细胞(PIECs),对支架材料的细胞相容性进行初步研究,探讨了其在组织工程支架材料领域应用的潜力。 1 mtt法检测细胞黏附与增殖 设计:对比观察。 单位:东华大学化学化工与生物工程学院。 材料:实验于2006-11/2007-10在东华大学化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程实验室完成。猪髋动脉内皮细胞(PIECs),由中国科学院细胞库提供。 主要仪器与材料:壳聚糖,粘均分子质量Mη≈106,脱乙酰度85%,济南海得贝海洋生物工程有限公司;Ⅰ型胶原蛋白,相对分子质量为(0.8~1.0)×105,四川铭让生物科技有限公司;六氟异丙醇,英国Fluorochem Ltd.;三氟乙酸、25%戊二醛水溶液、乙醇、二甲亚砜,国药集团;DMEM细胞培养基、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清,杭州吉诺生物医药技术有限公司;MTT试剂,美国Sigma;苏木精-伊红染色试剂盒,海门市碧云天生物技术研究所;血细胞计数板,上海求精生化试剂仪器有限公司;MK3酶标仪、二氧化碳培养箱,美国热电集团;倒置荧光显微镜,奥林巴斯公司;S-2700型扫描电镜,日立公司。 设计、实施、评估者:设计为第一作者,实施为全部作者,评估为第三和第五作者,评估者经过正规培训。 技术路线: 静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维与支架预处理:参考文后参考文献报道的方法,以六氟异丙醇/三氟乙酸为混合溶剂,配制质量分数为0.06的壳聚糖和质量分数为0.08的胶原蛋白溶液,制备壳聚糖∶胶原蛋白质量比依次为100∶0,80∶20,50∶50,20∶80,0∶100的混合溶液。电纺过程中采用钝口22G医用针头,溶液置于2.5 m L医用注射器中,控制电压为20 k V、接收装置距离为12 cm、供液速率为0.8 m L/h,制备壳聚糖/胶原蛋白复合纤维。制备好的支架材料在室温下经25%戊二醛蒸气交联12 h后真空充分干燥。支架材料置于24孔细胞培养板里,体积分数为0.75的乙醇浸泡4 h,换PBS浸泡4 h,PBS冲洗3遍,每孔滴加100μL DMEM细胞培养基(以刚覆盖材料为宜),于37℃二氧化碳培养箱烘干备用。 SEM观察:将支架材料使用导电胶固定在样品台上,表面喷金后在扫描电镜下观察,采用图像分析软件Image J测定电镜照片中的纤维直径分布范围。 细胞培养与接种:猪髋动脉内皮细胞(PIECs)用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、含体积分数为0.05的CO2培养箱中常规方法培养,每24 h更换培养液,分离传代备用。2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心、悬浮、血细胞计数板计数,将细胞悬浮液接种至24孔细胞培养板的壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维上,继续培养。 细胞形态学观察:苏木精-伊红染色法观察支架材料细胞形态。具体步骤,用40 g/L多聚甲醛固定10 min,蒸馏水洗涤2 min,换用新鲜的蒸馏水,再洗涤2 min。苏木精染色5 min,浸入自来水中冲洗去多余的染色液,约10 min。蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟),体积分数为0.95的乙醇5 s。