《多聚酶链式反应扩增DNA片段》教学.ppt

特别提示：①PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染。 ②在操作中离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。 多聚酶链式反应 扩增DNA片段 1.理解PCR的原理和反应过程。(重、难点) 2．尝试PCR技术的基本操作。 3．说出PCR技术的应用。 一、PCR扩增的原理及条件 1．概念：PCR即__________________，是一种________迅速__________的技术。它能以极少量的________为模板，在短时间内复制出上百万份的________。 体外 扩增DNA DNA 多聚酶链式反应 拷贝 2．原理 (1)DNA的热变性：在__________的温度范围内，DNA___________结构解体，________分开，这个过程称为________。当温度缓慢________后，两条彼此________的DNA链又会重新结合成________。 (2)子链的合成：①需要______________；②合成方向总是从子链的______________。 80～100℃ 双螺旋结构 双链 变性 降低 分离 双链 DNA聚合酶 5′端到3′端 3．条件 (1)________模板。 (2)分别与模板DNA相结合的两种________。 (3)A、T、G、C四种_____________。 (4)________DNA聚合酶。 (5)需要稳定的________和能严格控制________的温控设备。 DNA 引物 脱氧核苷酸 耐热的 缓冲液 温度 二、PCR反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为________、________和________三步。 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与________结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈________扩增。 变性 复性 延伸 引物Ⅱ 两个引物 指数 DNA分子能准确复制的原因是什么？ DNA分子独特的双螺旋结构为复制提供了精确的模板，通过碱基互补配对，保证了复制能够准确地进行。 课 堂 合 作 探 究 一、PCR反应与体内DNA复制的比较 PCR扩增反应与体内DNA复制的比较 体内DNA复制 PCR反应 不 同 点 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至95℃左右，双链全部解开，不需要解旋酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 合成 子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃ 体内DNA复制 PCR反应 不 同 点 特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增 TaqDNA 聚合酶 不需要 需要 循环 次数 受生物体自身控制 30多次 温度 体内温和条件 高温(可变) 相同点 ①需提供DNA复制的模板 ②四种脱氧核苷酸为原料 ③都需要一定的缓冲溶液 ④子链延伸的方向都是从5′端到3′端 二、PCR的反应过程 1．变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 2．复性 温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 3．延伸 温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 如下图所示： PCR过程与细胞内DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(　　) ①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中，DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制 A．③④　　　　　 B．①② C．①③ D．②④ [解析]　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。答案为C [答案]　C 下列操作过程的叙述中错误的是(　　) A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存 C．PCR所用的缓冲液和