松茸壳多糖对小鼠免疫细胞的影响.docxVIP

松茸壳多糖对小鼠免疫细胞的影响 糖是来自高等植物、动物膜和微生物细胞的天然药物。已经提取了300多种。这些天然产物中的糖对肿瘤、抗菌、阻力、抗衰老、降血糖、降血脂、预防溃疡和提高人体吸引力有显著影响。 松子壳多糖(pine nut shell polysaccharide,PSP)是从松子壳(松塔)中提取的酸性多糖成分,其在抗肿瘤、抗病毒和免疫促进剂作用方面研究较多。本试验着重探讨松子壳多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬功能及NK细胞杀伤活性的影响,考察松子壳多糖对小鼠的免疫调节作用,旨在为新型免疫调节剂的研发奠定一定的实验基础。 1 材料和方法 1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠20只,雌雄各半,体重18~22g,购于第三军医大学实验动物中心[SCXK(渝)2007-0002]。 1.2 培养基和细胞培养板 松子壳多糖(PSP),由吉林大学农学部生化教研室提供,以双蒸水配成10 mg/m L母液,临用时以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。 RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司);胰酶(Amersco公司);小牛血清(杭州四季青公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司),以含10%小牛血清的RPMI-1640培养基配制,浓度为5 mg/m L;红细胞裂解液(Tris-NH4Cl,p H 7.4);吩臻二甲酯硫酸盐(PMS)(Biochemika公司);刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、氧化型辅酶I(NAD)、左旋乳酸和碘硝基氯化四氮哩(INT)(Sigma公司);中性红生理盐水溶液,浓度为0.1%;分析纯二甲基亚砜(DMSO)(金山化工厂);细胞培养板(Coster公司)。Yac-1细胞系(吉林大学农学部免疫教研室惠赠)。 1.3 气相色镜观察 酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司);CO2孵箱(美国SHELLAB公司);倒置显微镜(OLYMPUS公司);低温高速离心机(德国Heracus)。 1.4 方法 1.4.1 小鼠体实验设计 在无菌条件下常规方法制备小鼠脾细胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640(完全培液)调整细胞浓度为5×106/m L制成脾细胞悬液备用。 PSP对小鼠脾细胞的毒性试验:取上述脾细胞悬液,加入96孔细胞培养板,100μL/孔。24 h后加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为1000、500、200、100、50和25μg/m L),设3个复孔;对照组加入完全培液,置5%CO2孵箱中37℃培养48 h,培养结束前4 h,每孔加入MTT 20μL,弃上清后每孔加DMSO100μL,振荡5 min,酶联免疫检测仪570 nm下测A值,取3复孔均值。 PSP对Con A诱导的小鼠T淋巴细胞体外转化的测定:如上述脾细胞悬液,加入96孔细胞培养板,100μL/孔。实验组及转化对照组每孔加入Con A10μL(终浓度5μg/m L),空白对照孔加入等量完全培养液。实验组加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为400、300、200、100、50和25μg/m L),设3个复孔;转化对照组加入完全培液。置5%CO2孵箱中,37℃培养48 h,按前述MTT法测定各A值,取3复孔均值。 PSP对LPS诱导的小鼠B淋巴细胞体外转化功能测定:方法同T淋巴细胞,只是丝裂原以终浓度20μg/m L的LPS代替Con A。 1.4.2 光皮细胞制备细胞pb和双标清液4. 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备:断颈处死小鼠后,75%乙醇消毒。剪开小鼠腹部外层皮肤,向其中注人无菌冷Hanks液5 m L,轻揉小鼠腹部后用注射器将腹腔液抽出,置于无菌离心管中离心(1200 r/min,5 min),沉淀弃上清,用完全培液制成2×106/m L的细胞悬液,将此细胞悬液加96孔培养板内,每孔100μL,置5%CO2孵箱中37℃培养2 h。弃掉未贴壁细胞,再用10%NCS RPMI-1640洗涤细胞3次,剩下的贴壁细胞即为制备的巨噬细胞。 PSP对巨噬细胞代谢的影响:将巨噬细胞与不同浓度的PSP共同培养24 h后,每孔加入MTT20μL(5 mg/m L),37℃5%CO2培养4 h后取出,弃上清后每孔加DMSO100μL,微量振荡器振荡5 min,酶联免疫检测仪570 nm下测A值,取3复孔均值。 PSP对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响:如上制备小鼠巨噬细胞,加入96孔细胞培养板内,每孔100μL,含2×105个巨噬细胞。实验孔加入不同稀释浓度的PSP,终浓度分别为400μg/m L、300μg/m L、200μg/m L、100μg/m L、50μg/m L、25μg/m L,每个浓度设3个复孔。对照组加入完全培液。置5%CO2孵箱中,37℃,饱和湿度连续培养24 h,然后每孔加入0.1%的中性