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桑黄菌一级种和二级种培养基的优化研究 桑黄是国际著名的生物抗癌领域中活性最高的细菌，对癌症的抑制率最为显著，其次是乳腺癌和癌痛症。因其治疗效果显著,风靡于日本和韩国,在韩国桑黄子实体一直作为灵丹妙药出售,其价格达到2 300美元/kg。由于外商大量从我国进口桑黄,造成近年来国内掠夺性的开采,而天然桑黄非常稀少,致使天然桑黄枯竭,人工栽培桑黄子实体迫在眉睫。而我国对桑黄的研究才刚刚起步,目前子实体栽培还未成功,适合桑黄生长的培养基也罕有报道。试验研究了桑黄菌一级种和二级种的最适培养条件,为子实体的培养提供了参考。 1 材料和方法 1.1 桑黄w和桑黄w 中国桑黄(W)、日本桑黄(R)、韩国桑黄(H)。中国桑黄(W)购自华中农业大学菌种实验室;日本桑黄(R)和韩国桑黄(H)购自山东济宁广大食用菌研究所。 1.2 桑黄菌耐干上染的培养 一级种:将3个桑黄菌种分别接种到13种不同配方的斜面培养基上进行恒温培养,每个处理平行做5只试管。培养温度为27～28℃。接种后第3天,菌丝进入快速生长期,每两天观察(并照相)1次,记录菌丝长度、菌落大小、菌落颜色、长势、染菌状况等。二级种:将刚刚长满试管斜面的三种桑黄菌(菌龄为10 d)分别接种到12种不同配方的菌袋里进行恒温培养。每个处理平行接3袋,培养温度为27～28℃,定时通风,并给与弱光以利发菌。接种后第5天,菌种萌发并向周围蔓延,每两天观察1次,在菌袋上划线以记录菌丝生长速度,并同时记录菌丝颜色、长势,感染杂菌状况等。 2 结果与分析 2.1 初级培养基的选择 2.1.1 蔗糖与蔗糖 图1为一级菌种生长10 d的照片,为配方2、6、10的比较,即仅有碳源不同。图片中从左到右碳源分别为葡萄糖、红糖、蔗糖。可以明显看出,葡萄糖为最佳碳源,红糖次之,蔗糖更差。分析原因是葡萄糖为单糖,菌丝体可以不用分解直接利用,故最容易被吸收,因而最适合菌丝生长;蔗糖是一种双糖,需要蔗糖酶分解成单糖后才能被利用,因桑黄菌丝不能合成这类酶而无法利用蔗糖,故蔗糖不能用来作桑黄培养的碳源;而红糖是一种未提纯的糖,主要成分还是蔗糖,另外还含有少量其他糖类以及一些维生素和矿物质,菌丝可以利用其中的部分糖类,而且红糖中的部分维生素和矿物质也在一定程度上促进菌丝生长,因而桑黄也可以勉强利用红糖生长。 2.1.2 添加氮源、碳氮比对马铃薯浸汁培养的影响 图2为一级菌种生长10 d的照片,为配方1、2、3、4的比较,即仅有氮源不同。图片中从左到右氮源分别为:不添加氮源、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏。可以看出,氮源的影响不是很明显,相比之下,不添加氮源的要比添加氮源的生长情况要好,菌丝浓密、长速也较快,添加氮源不能促进菌丝生长,反而起了抑制作用。氮源是真菌生长的重要营养物质之一,足够的氮源和合适的碳氮比能促进菌丝的生长。试验发现配方1的菌丝生长情况良好,说明马铃薯浸汁已能提供足够的氮源,并且碳氮比已经合适,不用再另外添加氮源。 另外,通过对培养13～18 d菌丝的观察,我们发现豆汁有抗褐变、抗衰老的能力。因为豆汁中含有多种维生素,尤其是维生素E,具有抗氧化的作用。故我们可以在培养基中添加维生素E,用以代替豆汁的抗衰老能力。 2.2 养基主要成分及植物生长情况 我们选择了12种不同配方的培养基,培养基主要成分及菌丝生长情况见表2。辅料均为石膏1.5%,硫酸镁0.2%,磷酸二氢钾0.3%。料水比为1:1.5。 2.2.1 桑黄、棉子壳生长情况 图3是二级种生长40 d的照片,每一照片中从左到右分别为配方1、5、9的菌丝生长情况,可以明显看出:配方1最适合桑黄菌丝生长,其菌丝生长速度最快,菌丝浓密,边缘相对整齐,颜色鲜黄;其次是配方5,而配方9最差,菌丝生长速度最慢,菌丝很稀疏,边缘不整齐，颜色白,容易染菌。不仅配方1、5、9的对比有这种明显的规律,配方2、6、10,配方3、7、11及配方4、8、12菌丝生长情况也呈现出同样明显的规律。这说明棉子壳做主料最适合桑黄二级种的生长。 棉子壳和木屑主要为桑黄菌丝的生长提供碳源。棉子壳的主要成分是纤维素、半纤维素,而木屑的主要成分是木质素。桑黄菌丝在棉子壳上生长得好,这说明菌丝中的纤维素酶系更发达,容易分解纤维素和半纤维素作为自身的碳源。而木质素主要依靠漆酶等多酚氧化酶来分解,说明菌丝中这类酶的活性不是很高,不太容易利用木质素,故木屑不适合作为桑黄培养的碳源。 2.2.2 氮源和维生素a 图4是二级种生长40 d的照片,照片上排为添加20%麸皮的配方料上菌丝生长情况、下排为添加10%麸皮的配方料上菌丝生长情况。总体来看添加麸皮量多菌丝生长情况更好,菌丝更浓密更茁长、生长速度也更快。尤其是对日本桑黄,添加20%麸皮的菌袋上部已经长出子实体原基(图5)。这说明麸皮作为一种氮源在桑黄二级种的生长中起到了良好