蛋白质免疫印迹技术.ppt

实验二蛋白质免疫印迹技术;一、免疫学;免疫学的讨论范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且进展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。 随着免疫生物学的进展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。; ;免疫系统功能的生理和病理表现;当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排解作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。 机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。; ;抗原和免疫原性;抗原的分类;抗体的种类;;抗原抗体反应（antigen-antibody reaction） 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。 体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用； 体外反应：可消灭凝集反应、沉淀反应、补体参加的反应及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采纳血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologic reaction）。;二、印迹法（blotting）;三、蛋白免疫印迹的应用;蛋白质免疫印迹检测技术;一、实验目的;二、实验原理;将适当的抗原物质注入动物体内，经过肯定时间，动物血清中可消灭大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血清。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。;（一）多克隆抗体的概念;抗体的结构;（二）用于免疫的动物;动物种类的选择主要依据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。 如要获得大量的抗体，多采纳大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采纳本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采纳纯系小鼠制备。 一般实验室采纳的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够供应足够数量的血清。 ;;（三）抗原;（四）免疫途径;皮下注射;（五）???剂;佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。 目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。;;（六）免疫方法;抗体的产生挨次与丰度;（七）抗血清的采集与保存;（八）抗血清质量的评价;效价?　抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向集中免疫法，此法对全部的抗体均适用。 某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双集中等方法测定。 ;单向扩射免疫法：?以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。 如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000 制备含有肯定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫集中。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清楚的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。 ;;双向集中法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上集中，两者在相交处产生沉淀线，以观察和推断抗血清中是否有抗体及其浓度。;;分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图;Western Blot原理;;免疫印迹的实验包括五个步骤： ⑴ 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 ⑵ 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避开特殊性抗体单独结合到膜上。;;三、实验仪器;动物的常规免疫;四、操作步骤;抗原的提取与制备 1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶） （周四下午）。 ;苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠;初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠 （1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态 （2）用酒精棉球消毒待注射部位 （3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL 初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫 ;加强免疫：初级免疫后两周进行。 取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。 加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小