CXCR4基因沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响.docxVIP

CXCR4基因沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响 陈烁;龚银银;颜景颖;汪慧敏;冉云;张涛【摘要】目的探讨CXCR4基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响.方法将T24细胞分为3组，即干扰组、阴性对照组和空白对照组.采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine2000将靶向沉默CXCR4基因的小干扰RNA(siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,Western-blot检测转染后T24细胞中CXCR4蛋白的表达水平,MTT比色法检测细胞凋亡,Transwell迁移试验观察T24细胞迁移能力结果转染siRNA后,CXCR4蛋白表达量明显下调(P0.05),与空白对照组及阴性对照组的T24细胞比较，沉默CXCR4基因后，显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(均为P0.05),促进T24细胞凋亡(均为P0.05);Transwell实验结果提示,RNAi干扰CXCR4表达后能显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(P0.05).结论RNAi干扰CXCR4表达水平能够抑制T24细胞增殖、促进细胞凋亡及降低细胞的迁移能力，推测CXCR4基因可能是膀胱肿瘤细胞增殖及迁移的重要调控因子之 【期刊名称】《福建医科大学学报》 【年(卷)，期】2019(053)003 【总页数】5页(P158-162) 【关键词】膀胱肿瘤;基因;RNA干扰;细胞增殖;细胞运动 【作者】陈烁;龚银银;颜景颖;汪慧敏;冉云;张涛 【作者单位】北京中医药大学深圳医院（龙岗）,深圳市龙岗区中医院外科龙岗518100;深圳市第二人民医院手术室，深圳518035;北京中医药大学深圳医院（龙岗）,深圳市龙岗区中医院外科，龙岗518100;北京中医药大学深圳医院（龙岗），深圳市龙岗区中医院外科，龙岗518100;北京中医药大学深圳医院（龙岗）,深圳市龙岗区中医院外科，龙岗518100;北京中医药大学深圳医院（龙岗）,深圳市龙岗区中医院外科，龙岗518100【正文语种】中文【中图分类】R329.2;R394.2;R737.14在我国，膀胱癌的发病率位居恶性肿瘤的第5位，位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第1位，且复发率高达50%~70%［1］。因此，探讨膀胱癌发生发展的分子机制，寻找可靠的生物学标志物和有效的基因治疗靶点，对提高膀胱癌患者的生存率显得尤为重要［2］。研究认为，CXCR4基因与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切［3-4］。本研究拟通过RNA干扰技术下调CXCR4基因的表达水平，观察CXCR4基因表达下调对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移功能方面的影响。 1材料与方法1.1材料人膀胱癌T24细胞株（中国典型培养物保藏中心）；兔抗人CXCR4抗体（美国RD公司）；转染脂质体Lipofectamin2000（美国Invitrogen公司）；RPMI1640细胞培养液及胰蛋白酶（美国Gibc。公司）；10%的胎牛血清（杭州四季青公司）；噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）；Transwell小室（美国Costar公司）；Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒液由中山大学附属第一医院胃肠外科王天宝教授馈赠。1.2方法1.2.1细胞培养及转染分组在无菌条件下，将人膀胱移行细胞癌T24细胞株置于含有10%胎牛血清、1%双抗（链霉素+青霉素）的RPMI1640培养液中培养，于37°C、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。转染前1天，把处于对数生长期的T24细胞以每孔5x105个的密度接种在6孔板中；次日，当T24细胞浓度达50%~70%时进行转染实验。将T24细胞分为3组：（1）干扰组，应用阳离子脂质载体Lipofectamine2000将小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）转染入T24细胞，转染5h后，更换含血清及抗生素的培养液再继续培养；（2）阴性对照组，将转染siRNA空载体作为阴性对照组；（3）空白对照组，不进行任何处理。 Western-blot检则取80凹蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，室温下封闭1h，加入用0.05%的Tween20TBS缓冲液稀释的CXCR4蛋白抗体（1:1000稀释），4C孵育过夜，再用TBS缓冲液漂洗3次，加入用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:1000）中，37C下温育1h，采用增强化学发光系统显色和拍照。采用相关软件分析各条带光密度值。实验重复3次，取均数作为该蛋白质的表达含量。 1.2.3检测细胞的死亡率取对数生长期细胞，调整浓度为1x105mL-1，接种于24孔培养板中，分别于转染24,48及72h后收取细胞，3200r/min离心3min,以适量体积重悬，用0.04%台盼蓝溶液与等体积细胞悬液混匀3min，计数活细胞和死细胞。 细胞死亡率（%）=死细胞总数/（活细胞总