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hflpme-hplc法结合测定6种黄酮类化合物 1 与药物的相互作用 黄酮类化合物广泛分布于蔬菜、水果、食品、药物和药物中。这是植物自长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。黄酮类化合物具有广谱的药理活性, 如抗菌、消炎、降压、抗氧化、抗癌及防癌等。药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一,影响药物在体内的分布、代谢和排泄速率,对药物的消除半衰期也有影响,更重要的是它与药物的药理作用强度密切相关。因此,药物血浆蛋白结合率的研究对新药研究开发及指导临床合理用药都具有重要意义。测定药物血浆蛋白结合率的方法有平衡透析法、超滤法、微透析法、毛细管电泳法及高效亲和色谱法等,研究黄酮类化合物与蛋白结合特性的方法主要有紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法和红外光谱法。徐倩等采用分子对接理论和荧光法研究了4种黄酮类天然产物与白蛋白的相互作用及作用机理。但尚未见黄酮类化合物与蛋白结合率的文献报道。近年来,中空纤维液相微萃取(Hollow fiber liquid phase microextraction, HFLPME)对复杂样品中微量组分的提取、分离、富集和浓缩起重要作用。中空纤维具有能使药物分子通过,生物大分子或结合药物的生物大分子不能通过的特殊结构。利用中空纤维的结构特性测定药物与蛋白的结合率已有报道。本研究采用该方法,同时、快速测定了6种黄酮类化合物与牛血清白蛋白的结合率;分析了6种黄酮类化合物同时存在时对蛋白结合的竞争作用;讨论了黄酮类化合物蛋白结合率的浓度依赖性;计算了结合常数和结合位点数。 2 scatchird方法学s HFLPME是将水相中的游离药物通过中空纤维的壁孔萃取到其管内微升级的有机溶剂萃取相中,萃取达平衡时,萃取相中分析物浓度与样品的初始浓度呈线性关系。当药物与蛋白结合达到平衡时,水相中的药物一部分以蛋白结合型药物存在,一部分以游离型药物存在。游离型药物通过中空纤维的壁孔被萃取到萃取相中,结合型药物被中空纤维壁的微孔有效阻挡,使蛋白结合型药物与游离型药物有效分离。在生物体条件下,利用HFLPME结合HPLC测定萃取相中游离药物(Df)的浓度,用药物总浓度与游离药物浓度差值计算结合型药物(DnP)浓度,从而得出药物与蛋白结合率。 药物与蛋白反应达到平衡时,蛋白结合常数K为: K=[DnP][Df]n[Pf](1)Κ=[DnΡ][Df]n[Ρf](1) 其中[Df], [Pf], [DnP]分别表示药物与蛋白结合达平衡时游离药物、游离蛋白、药物-蛋白复合物的平衡浓度。 设药物的总浓度为[D0],则: [DnP]+[Df]=[D0] (2) 药物的蛋白结合率fd为:fd=[DnP][D0]=[D0]?[Df][D0]fd=[DnΡ][D0]=[D0]-[Df][D0](3) 设蛋白总浓度为[P0],则: [DnP]+[Pf]=[P0] (4) 蛋白与药物的结合位点是相互独立的,其平衡关系可以用多级平衡方程式(5)表示: R=[DnP][P0]=[D0]?[Df][P0]=Σi=1mniKi[Df]1+Ki[Df](5)R=[DnΡ][Ρ0]=[D0]-[Df][Ρ0]=Σi=1mniΚi[Df]1+Κi[Df](5) 其中,R为结合比(一个蛋白键合的药物分子数),m为结合位点总类数,ni为第i类位点数,Ki为第i类位点的结合常数。如果药物与蛋白只有一类结合点位,即m=1,方程可以简化为: R=nK[Df]1+K[Df](6)R=nΚ[Df]1+Κ[Df](6) Bjerrum方法:根据式(6),以R对log[Df]作图,得到带有明显拐点的S型曲线,即Bjerrum图。Bjerrum法认为:如果药物与蛋白的结合分子数与结合位点数相等,Bjerrum曲线拐点处对应纵坐标R值为该药物与蛋白的结合位点数(即Rmax=n),Bjerrum曲线拐点对应横坐标的倒数为K。 Scatchard方法:由式(6)变形得到: R/[Df]=nK-RK(7) 根据式(7),以R对R/[Df]作图或进行线性回归,得到Scatchard 方程。Scatchard 法认为:假设每个结合位点结合一个药物分子,则Scatchard 方程斜率的负数为结合常数即K。一个结合位点或几个结合位点与药物有相同的亲和力,则Scatchard方程为一条直线;如果两个结合位点有不同的亲和力,则Scatchard方程为两条直线,分别对应两个结合位点。 3 实验部分 3.1 药品、化学品和其它试剂 Technologies 1200 Series高效液相色谱仪(Agilent公司);槲皮素(批号:081-9003,纯度≥98%)和白杨素(批号:111701-200501,纯度≥98%)对照品购自中国药品生物制品检定所; 山柰素(批号:A0