不同地区红色毛癣菌的体外抗真菌药物敏感性研究.docxVIP

不同地区红色毛癣菌的体外抗真菌药物敏感性研究 浅部真菌病是人类常见病和常见疾病之一。服用几种药物很长时间，很难治愈。本试验应用特比萘芬、酮康唑、萘替芬及联合使用酮康唑萘替芬对临床分离红色毛癣菌进行了体外药敏实验。调查联合应用抗真菌药物的效果,同时探讨可能影响药物敏感性的因素。 1 材料和方法 1.1 手、足充血药检测 165株临床分离红色毛癣菌菌株采集于门诊皮肤科患者的体、股癣及手、足癣标本,其中北京协和医院41株、南京皮肤病研究所81株、上海长征医院及上海长海医院43株,经常规镜检、生理生化和API20C AUX鉴定。质控菌株选用近平滑念珠菌ATCC22019。 1.2 外加剂用量milipore-m 1640培养基含BPMI-1640粉10.4g/L(Life Technologies Inc),三氦吗啡啉丙磺酸(MOPs,Fluka)34.53g/L以1 mol/L NaOH调节pH至7.0(25℃),用Millipore滤过灭菌(滤膜0.22μm)。改良沙氏固体培养基(SDA)葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂2%,加氯霉素0.05mg/ml,115℃高压蒸汽消毒20min,分装平皿和试管,置4℃冰箱保存备用。 1.3 药物的配制及倍比稀释 药物分别为酮康唑、萘替芬及特比萘芬,由重庆华邦制药有限公司提供原药,含量为99.9%,符合《中国药典》2000年版的质量要求。实验共分为4组:酮康唑组、萘替芬组、特比萘芬组及联合用药组。联合用药组药物由酮康唑及萘替芬按比例混合。依据M38-A方案配制上述药物的贮存液。酮康唑的浓度为128μg/ml,萘替芬、特比萘芬及联合用药的浓度为1μg/ml。 药物的倍比稀释:按照M38-A方案,用1640培养基做10级倍比稀释。无菌条件下,在96孔细胞培养板内各加入100μl培养基,以8头移液器吸取100μl药液,加入第1孔,充分混合后吸取100μl混合液加入第2孔,依次类推,加至第10孔后吸取100μl弃去。第11、12孔为生长和空白对照孔。 1.4 各菌株的培养 将受试菌株接种于改良沙氏固体培养基(SDA)上35℃培养5～10d充分活化后,加入1 ml的生理盐水,巴氏吸管轻轻抽吸,将有孢子和菌丝片断的菌悬液置于无菌试管中,倒入研磨器研磨均匀后经血细胞计数板调整菌悬液浓度至5×106CFU/ ml。然后用RPMI1640培养液将菌丝悬液稀释为5×104CFU/ml,两倍于终浓度。 各种药物组的96孔板中,除第12孔为空白对照外,其余各孔加入各菌株菌丝悬液100μl。35℃下培养5d后观察结果。此时菌丝终浓度为2.5×104CFU/ml,药物终浓度:酮康唑为0.063～32μg/ml,萘替芬、特比萘芬及联合用药组为0.0005～0.25μg/ml。 1.5 严格控制mic值 ATCC22019为参考菌株,其酮康唑MIC参考值为0.06～0.25μg/ml,每次试验以此株菌为参照,当MIC值位于该范围,认为试验操作准确有效。同时设立空白和生长对照。 1.6 按mic值的终点 于培养5d后观察受试菌株结果。用视觉法判定终点,按M38-A方案要求以80%生长抑制所对应的最低药物浓度为MIC值。在自然光线下由多人同时判定结果,以保证结果的稳定性。 1.7 最低抑菌浓度 计算抑菌浓度指数(Fractional Inhibitory Index,FICI),即联合用药时各药的最低抑菌浓度分别除以各药单用时MIC值的商之和。FICI≤0.5时为协同作用,0.5FICI≤1时为相加作用,1FICI≤2时为无关作用,FICI2时为拮抗作用。 1.8 sng-q检验 将各药单用及联用时的两组MIC值转换为对数后进行SNK-q检验,P0.05时认为有统计学差异。对比北京、南京、上海三地红色毛癣菌的MIC值差异采用秩和检验,P0.05时认为有统计学差异。 2 联合用药对菌株mic值的影响 2.1 4组抗真菌药物对3地红色毛癣菌药敏试验的MIC值几何均数结果见表1。各药物组的MIC值转换为对数后经SNK-q检验,发现联合用药组MIC值小于单用酮康唑、萘替芬组(P0.05),联合用药组与特比萘芬组的MIC值之间无统计学差异(P0.05)。联合用药在95%的菌株上表现为协同或相加作用,见表2。 2.2 各地区红色毛癣菌对各药物组的MIC值的秩和结果见表3,对以上结果进行Friedman M秩和检验并经q检验的结果见表4。结果显示在采集于北京的菌株对药物的敏感性除了在特比萘芬组外都普遍低于上海的菌株,除了酮康唑组外都明显低于南京的菌株,而上海同南京的菌株在对药物的敏感性方面没有显著差异。 3 抗真菌联合用药试验结果 浅部真菌感染是皮肤科的常见疾病,红色毛癣菌是主要的致病真菌之一。外用抗真菌药物相对安全、廉价、方便,是治疗浅部真菌