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影响沙田柚茎尖嫁接成活率的因素 柑橘病毒通常发生在世界各地的40多个生产区。这些病原体（如病毒、细菌和原生动物）通常存在于长期无性繁殖的老品种中，这可能会减少植物生长、产量和品质，并严重威胁到柑橘生产。目前最常见的培育柑桔无病原体苗的方法主要包括热处理法、珠心胚培养、茎尖培养及茎尖嫁接等4种。热处理法虽然能有效地去除大多数病原体,但对于那些基本的病毒如裂皮病毒、顽固病毒的脱除却非常困难。珠心胚培养已被证明会产生童期性状,且多变异。茎尖培养则存在着增殖和生根极其困难的问题。 茎尖微嫁接技术自Navarro等首次应用于柑桔脱毒后,在近20 a内得到了迅速的发展。由于它既不会产生变异,也不带童期性状,如结合适当的热处理又很容易脱除绝大多数病原体,因此已成为最有效的获得柑桔无病原体苗的途径。沙田柚作为目前柑桔发展最为迅速的一个品种,正越来越多地受到如黄龙病等病原体病害的侵袭,快速培育沙田柚无病原体苗已成为生产中极为迫切的问题。本文以广东梅州成年沙田柚树为材料,初步研究了提高沙田柚茎尖嫁接成活率的一些因素,以期为今后大规模生产沙田柚无病原体苗提供一些有益的借鉴。 1 材料和方法 1.1 细胞培养、污水处理 供试接穗品种为成年沙田柚树(Citrus grandisOsbeck cv. Shatianyou),采自广东梅州;砧木为枳壳(Poncirus trifoliataRaf.),采自广西桂林。实验时间为1999年9～10月。 1.2 方法 1.2.1 内外材料的消毒接种 从成熟枳壳果实中取出种子洗净,用双层棉纱包住置于55～58 °C热水中处理50 min,0.1% HgCl2消毒10～15 min,无菌水冲洗3～4次,剥去内外种皮,然后接种于1/2 MS培养基上进行黑暗培养,温度保持在于25～28 °C。采摘约1～2 cm健康的成年沙田柚嫩芽,剥去较大叶片,切取0.5～1 cm茎尖,75%酒精浸泡约30 s,0.1% HgCl2消毒6～8 min,无菌水冲洗3～4次后用作接穗。 1.2.2 实生苗的培养 基本的嫁接方法采用李耿光等的方法,略作修改。将接穗在显微镜剥至带2～3个叶原基的茎尖(约0.14～0.18 mm),将其置于去顶的枳壳实生苗上,再整株移入带滤纸桥的液体培养基上进行培养,基本培养基采用MS(蔗糖浓度7.5%,pH 5.8)。培养温度保持在于26±2 °C,光照为2 000 lx,每天14～16 h。培养1周后,除去砧木上长出的不定芽以减少对接穗萌发的影响。待接穗长出2～3片叶后将植株转入更大的试管继续培养,同时蔗糖浓度减至2%,此时计算成活的嫁接苗(1个月左右)。 1.2.3 微生物滤膜消毒 不同浓度的GA3、6-BA及IBA用FA0.45 μm微孔滤膜过滤消毒后待用。将已准备好的接穗及砧木切口部分别置于上述溶液中浸泡约30 s后进行嫁接,嫁接方式采用传统的倒“T”字形。 1.2.4 营养钵薄液 带3～4片伸展叶片的嫁接苗从培养室中移出,在室内自然光下进一步培养1周左右,然后取出用蒸馏水洗净,再置于5 mg/L IBA溶液中浸泡24 h后单株移入营养钵中。营养土采用50%塘泥∶50%黄泥混合,嫁接苗在外罩遮阴网的网室中正常生长,其移栽成活率高达90%以上。 2 结果 2.1 苗龄对沙田柚茎尖嫁接成活率的影响 黑暗培养的枳壳实生苗分成10、12、14、20、25 d五种,接穗大小为带2个叶原基的茎尖,采用传统的倒“T”字形嫁接。由表1可知:砧木的苗龄以14 d时沙田柚茎尖成活率最高,此后随着苗龄的增加,嫁接成活率逐渐下降。苗龄较小的幼苗,其嫁接成活率也较低。尽管所采用的砧木及接穗品种有所不同,但是我们的结果与Navarro等及李耿光等是基本一致的。 2.2 叶原基接穗成活率高 茎尖嫁接时所采用的接穗大小直接影响到嫁接成活率,以前一般认为当采用较大的接穗时成活率较高。我们的结果表明:带4个叶原基的茎尖嫁接成活率最高,为28.6%,此后若接穗过大也会降低嫁接成活率。考虑到接穗太大会影响到嫁接苗的脱毒效果,因此我们认为接穗大小仍以带2～3个叶原基的茎尖为最佳。 2.3 中间三角形嫁接法与中间三角形嫁接法的对比 由表1可知,不同的嫁接方式对茎尖嫁接成活率也具有一定的影响。常规的倒“T”字形嫁接法与后来改进的中间三角形嫁接法并没有太大的区别,它们的嫁接成活率均为20%,这点与蒋元晖的结果不太一致。但若在嫁接后采用parafilm胶缠绕固定切口处,可显著提高嫁接成活率(达到35%以上),而且这种影响与切口的形状关系并不太大。 2.4 蔗糖浓度对接穗成活率的影响 由表1可知,液体培养基中蔗糖浓度对茎尖嫁接成活率的影响非常显著。当蔗糖浓度为7.5%时沙田柚苗的嫁接成活率最高,达19%。当蔗糖浓度低于7.5%时,幼苗则极难成活,我们还