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贵州烤烟裸种携带真菌的分离与鉴定 卷烟是中国的一个重要作物，其产量占世界卷烟产量的39.6%。随着栽培条件的变化, 烟草病虫害的危害日益严重, 造成的经济损失巨大。据不完全统计, 我国每年烟草病害造成的直接经济损失在7亿元以上。烟草病害的发生存在于烟草生长的各个时期, 其中, 由烟草种子为载体或媒介传播、侵染新生烟株引起的烟株局部或整体发生的病害称为烟草种传病害。烟草种子是传播烟草病原菌最主要的途径之一。种传病原菌通常存在于种子表面或内部, 或以各种病残体直接或间接混杂于种子之间。这些病原菌往往是烟草病害的初次浸染来源。据报道种子传播引起的烟草真菌性病害有烟草炭疽病、烟草赤星病、烟草霜霉病和烟草低头黑病等。这些病害均可导致苗期和大田期烟草病害的大量发生, 对烟草的生产造成严重损失。 从源头上发现烟草种传病原真菌, 对其进行分离、鉴定以及病原菌生物学习性的研究, 开展种子消毒技术研究和研发新型种衣剂是提高烟草抗病能力的关键。然而, 烟草种子的加工和处理都是建立在对烟草种传病原菌研究的基础之上。本研究以贵州省烟草良繁烤烟良种K326、贵阳4号、韭坪2号和南江3号的裸种为材料, 对烤烟种子真菌性病害带病率进行检测, 并进行病原菌的分离与鉴定及多样性分析, 旨在为烟草种子的加工处理提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 裸种及良繁株 供试烤烟品种为K326、贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号, 所有裸种均由贵州省烟草科学研究院良繁中心提供, 每品种360粒。种子病原真菌的分离采用PDA培养基, 于2013年8月在贵州省烟草科学研究院微生物实验室进行。 1.2 生长曲线测定 参照培养皿小苗法, 将供试烤烟种子作不消毒处理, 按6×6方阵排列, 均匀地播种于盛有用无菌水保湿滤纸的无菌平板 (直径9 cm) 中, 置于28℃恒温培养箱中, 在每天交替光照、黑暗各12 h下培养12 d, 检查和记录烤烟种子真菌性病害带菌情况。 1.3 病原菌的纯化 无菌条件下制备PDA平板。上述种子经12 d培养后形成带病情况不同的烟苗, 选取带有不同形态、颜色和生长速度菌落的病原菌烟苗, 挑取少量菌丝或者孢子至于PDA平板, 于28℃黑暗条件下培养, 6 d后对长出的菌落进行纯化, 将纯化的病原菌至于盛有15%无菌甘油的菌种保存管中, 于-20℃长期保存、备用。 1.4 真菌基因组dna的提取 将分离到的各种病原菌转移到PDA培养基进行培养, 挑取各种病原菌的菌丝和孢子于显微镜下进行形态学鉴定。同时, 利用宝生物工程 (大连) 有限公司的真菌基因组DNA提取试剂盒 (Ta Ka Ra Code:D304) 提取各种病原菌的基因组DNA。利用真菌核糖体基因转录间隔区 (ITS) 通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 对病原菌的r DNA-ITS区进行PCR扩增 2 结果 2.1 烟苗被真菌感染 烤烟种子真菌性病害对种子和烟苗的危害如图1所示。烤烟种子在被病原真菌侵染后, 主要表现为烟苗被真菌侵染, 继而死亡。K326、贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号的种子真菌性病害带菌率各不相同, 结果如表1所示, 其带菌率分别为15%、77.78%、21.67%和61.39%。 2.2 烟草种子真菌主要种类、分布及分布特点 随机挑取危害症状和菌落形态相同的病原真菌进行分离和鉴定, 鉴定结果如表2所示。从烤烟K326上共分离到3种病原真菌, 其优势病原菌为链格孢属 (Alternaria sp.) , 所占比例为66.67%。从贵烟4号上共分离到9种病原真菌, 其中优势病原菌为支孢样支孢霉 (Cladosporium cladosporioides) 和链格孢属, 其占比例分别为45.45%和13.6%。从烤烟韭菜坪2号上共分离到5种病原真菌, 其中优势病原菌为链格孢属, 其占比例为60%。从南江3号上共分离到10种病原真菌, 其中优势病原菌为镰孢菌属 (Fusarium sp.) 和赤霉菌属 (Gibberella sp.) 。其所占比例分别为40%和30%。 鉴定结果表明, 烟草种子真菌性病害病原菌较多 (表2) , 病原菌主要分布于链格孢菌属 (Alternaria sp.) 、拟茎点霉属 (Phomopsis sp.) 、支顶孢属 (Acremonium sp.) 、柄孢壳属 (Zopfiella sp.) 、曲霉属 (Aspergillus sp.) 、镰孢菌属 (Fusarium sp.) 、青霉菌属 (Penicillium sp.) 、赤霉菌属 (Gibberella sp.) 、芽枝孢菌属 (Cladosporium sp.) 、离蠕孢属 (Bipolar