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烟草花叶病毒的诱变选育及交互保护作用研究 由于松茸（tv）引起的卷烟花叶病是卷烟生产中最重要的疾病之一。利用弱势植物保护寄生虫避免感染同类型病毒的侧支是当前国内外病毒防治的热点之一。对于弱毒植物的获取方法很多。除了自然过滤外，还可以通过物理因素（如辐射、热处理）和化学因素（如亚硝酸）对强毒植物进行人工诱导。由于mtv的自然武变率低，难以获得弱毒植物，因此采用人工武变法可以快速实现突变目标。因此，mtv弱毒植物通常采用人工诱导和转化方法。在本实验中，通过处理、亚硝酸盐诱导和混合处理，对vmv强毒株进行诱导和筛选，并分析影响相互作用保护的因素。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 病毒毒源 采自福建龙岩烟区的典型烟草花叶病株,经心叶烟连续4次单斑分离后,繁殖在普通烟上. 1.1.2 烟台草品种 为普通烟品种(K326),由福建省大田县烟草公司提供. 1.1.3 抗血小板聚集抗血清 TMV普通株系的抗血清由福建农林大学植物病毒研究所制备,用琼脂双扩散法测定其效价为1∶100. 1.1.4 种子和消毒 供试鉴别寄主植物种子部分由厦门华侨亚热带引种植物园徐平东博士赠送,部分购自市场或采自野外.所有种子均用质量浓度为0.1 g·mL-1Na3PO4消毒后使用. 1.2 强制改变方法 1.2.1 病汁液接种方法 以分离纯化的TMV强毒株为材料,参照後藤忠则ら的方法,35 ℃热处理15-16 d.以K3PO4缓冲液(1/15 mol·L-1,pH7.2)100倍稀释(W/V)的病汁液接种心叶烟为对照. 1.2.2 硝酸处理 参照郑贵彬等的方法,处理10-40 min. 1.2.3 综合处理 取35 ℃热处理15 d的茎部,再经上述亚硝酸处理. 1.3 elisa法检测多态性烟株中的毒株和毒株 记录小型单斑数和总斑数.单斑分离参照Yeh et al的方法,1个单斑接种1株普通烟.观察20 d,淘汰有表现症状的烟株,无症状的烟株用间接ELISA法检测.阳性反应的植株接种心叶烟复检,阴性反应的植株接种强毒株. 1.4 虚弱毒症的筛选 1.4.1 中毒的评估 将经间接ELISA法检测确定为带毒但不表现症状的病株接种于心叶烟,单斑分离后接种普通烟,并观察其症状表现,以同样方法连续接种4代. 1.4.2 接种叶和系统叶 参考覃秉益等方法,稍作修改.接种弱毒株时,第1次接种后隔10 min左右重接1次.接种14 d后用间接ELISA法检测植物的接种叶和系统叶,检测为阳性的植株继续观察症状的表现. 1.5 接种前和接种后取样 强、弱毒株分别接种团棵期普通烟的第4叶位叶片,各重复3株.弱毒株接种方法同1.4.2.分别于接种前及接种1 d后开始取样.接种部位包括接种叶和接种叶的上3位叶.取样方法:用直径为8 mm的打孔器在重复的3株上各取1圆片,将3个圆片合在一起称重,按1∶10(W/V)加入包被缓冲液,-20 ℃保存,最后用间接ELISA法检测. 1.6 强、弱毒株增殖速率的测定 采用正交设计法,以L9(34)方案安排试验,每组重复10株.考察因素包括弱、强毒株接种浓度,接种间隔时间,强毒株的接种部位及烟株生育期等.强、弱毒株的病叶分别用K3PO4缓冲液(0.1 mol·L-1,pH7.2)100倍稀释(W/V),接种心叶烟,测定枯斑数,确定强、弱毒株的接种浓度.取强毒株浓度高于弱毒株浓度,强、弱毒株浓度相同及强毒株浓度低于弱毒株浓度3个位级.烟株生育期分为幼苗期、团棵期及成熟期.根据强、弱毒株增殖速率的测定结果,确定弱、强毒株的接种间隔时间,取弱毒株处于潜伏期、弱毒株增殖并输送到系统叶上及弱毒株在烟草植株中充分扩展这3个时间段.强毒株接种部位分别为弱毒株接种叶的上位叶、接种叶及下位叶.观察症状,接种强毒株30 d后记录结果,统计病株率. 2 结果与分析 2.1 小型枯斑的诱变效果 TMV的强毒株与弱毒株在心叶烟上可出现2种不完全相同的枯斑,前者为大型淡色枯斑,后者为小型枯斑,故以小型枯斑作为突变成弱毒株的标志,诱变结果见表1.未经诱变剂处理的N1/N2值为0.803;而35 ℃热处理、亚硝酸处理及复合处理的N1/N2值都有所提高,说明3种诱变处理都可以有效提高突变频率;而复合处理的N1/N2值与对照相比提高显著,较单独处理也有明显的提高,说明复合处理具有较好的协同效应. 2.2 虚弱毒症的筛选 2.2.1 带毒烟草植株的筛选 单斑分离共接种了258株烟苗,20 d后淘汰37株有表现症状的烟苗.用间接ELISA法检测不表现症状的烟苗,其中17株为阳性反应,15株陆续出现症状,只有代号为017、022的2个突变株表现相当稳定,即不表现症状.以间接ELISA法检测为阴性的烟苗接种强毒株,发现有1株连续2次均不表现症状,将其接种于心叶烟,有枯斑产生,其标