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烟草黄瓜花叶病毒病的防治研究 黄瓜花叶病毒（cmv）属于麦托中毒的科成员。它是分布最广泛、影响最大、最具经济意义的病毒之一。世界范围内所有烟草和蔬菜种植区均有该病毒的分布和危害,可侵染约36科双子叶和4科单子叶的千余种植物。烟草和蔬菜感染后造成品质和产量下降,甚至绝收,给农业生产带了严重的经济损失。 真菌多糖是存在于大型真菌子实体、菌丝体中通过糖苷键连接多个单糖而构成的高分子聚合物。真菌多糖资源丰富、具有丰富的生物活性,而且易被微生物降解、对环境无污染,是目前及具开发前景的药物新资源。安络小皮伞(Marasmiusandrosaceus)系担子菌纲、白磨科小皮伞属真菌,主要活性组分是水溶性多糖,相关医学研究表明其水溶性多糖具有提高机体免疫力,抗肿瘤等多种活性,是一种传统的镇痛和抗风湿的保健中药,对人体无毒副作用。医学研究表明,真菌多糖可通过抑制病毒吸附、干扰病毒复制和提高机体免疫力等途径,有效抑制人体病毒病的侵染传播。Collins等发现云芝多糖不但能抑制HIV-1与宿主细胞结合,而且能显著抑制HIV-l逆转录酶活性,从而抑制病毒复制。但真菌多糖对植物病毒的抑制作用鲜见报道,吴艳兵发现毛头鬼伞多糖对 TMV 具有较强的体外钝化及抑制 TMV 侵染复制作用,可有效预防TMV病毒病。许玉娟发现喷施苍耳多糖后,可有效抑制TMV侵染心叶烟,推测可能是苍耳多糖通过诱导增强防御酶活性进而抑制TMV。 为了筛选得到对烟草上黄瓜花叶病毒病(CMV)具有显著抑制作用的真菌多糖,明确真菌多糖处理对烟苗相关防御酶的影响,本实验将采用半叶法,从安络小皮伞多糖等21种真菌多糖中筛选出对(CMV)具有显著抑制作用的多糖,并探索其对烟苗相关防御酶活性变化的影响,为进一步开发安络小皮伞多糖防治 CMV 病毒病提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 试验中的茶多酚 表1中21种多糖均由本实验室提取、制备和纯化,并于铝箔袋密封室温保存备用。 1.1.2 sicamacumvar.nc29 枯斑三生烟(Nitcotiana tabacumvar. Samsun NN)、普通烟NC-89(Nitcotiana tabacumvar. NC89),由陕西省烟草研究所提供。所用育苗物质经消毒后,于防虫温室内种植。 1.1.3 烟草的保存 黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV),为西北农林科技大学植物保护学院保存在防虫温室中普通烟草上。制备供试病毒接种液时,取1 g CMV感病叶片,加少量石英砂,于10 mL PBS 溶液中研磨成匀浆,纱布过滤,无菌水稀释至100 mL 备用。 1.1.4 化学试剂及仪器 邻苯二酚,购于国药集团化学试剂有限公司;L-苯丙氨酸,购于国药集团化学试剂有限公司;愈创木酚,购于国药集团化学试剂有限公司;紫外分光光度计(DU800 nucleic acid/protein analyzer,购于Beckman Coulter公司);高速冷冻离心机(Avantiue617J-E Centrifuge, 购于BECKMAN COULTER公司)。 1.2 分离、制备多糖 本实验所用的21种多糖均按照改良后的谢红旗方法提取;菌株子实体预处理 → 沸水浸提 → 提取液合并、浓缩 →乙醇沉淀 → 冷冻干燥 → 粗多糖 → 乙醇沉淀洗涤(3次)→ 水溶解 → Sevag除蛋白 → 透析 → 活性炭脱色 →透析→冷冻干燥→ Molisch反应鉴定多糖。 1.3 抗毒菌和多酚筛选 1.3.1 供试病毒液和半叶法接种 选取7叶期长势一致的枯斑三生烟,打顶,留3-4片叶,培养1周。将50 mL稀释为200和400倍液的21种多糖液分别与等量的供试病毒接种液混合,静置30 min后,用半叶法摩擦接种到烟叶半叶,另半叶摩擦接种清水与供试病毒液混合物为对照。然后于温室中培养,每处理3株,重复3次。待出现典型枯斑症状后统计枯斑数,计算钝化效果: 钝化效果=(处理半叶枯斑数-对照半叶枯斑数)/对照半叶枯斑数×100%。 1.3.2 喷水后接种病毒液 将稀释为200和400倍液的21种多糖液分别喷施到7叶期枯斑三生烟烟叶半叶,另半叶为喷清水对照。于喷施处理24、48 h后,对各处理及对照烟叶全叶摩擦接种病毒液。然后于温室中培养,待出现典型枯斑症状后统计枯斑数,计算预防效果: 预防效果=(处理半叶枯斑数-对照半叶枯斑数)/对照半叶枯斑数×100%。 1.3.3 喷施多糖液 将供试病毒接种液摩擦接种到7叶期枯斑三生烟烟苗叶片全叶,分别于处理0,24 h后,将稀释为200和400倍液的21种多糖液喷施到处理烟叶半叶,另半叶为喷施清水对照。然后于温室中培养,待出现典型枯斑症状后统计枯斑数,计算治疗效果: 治疗效果=(处理半叶枯斑数-对