曼地亚红豆干杉叶片粗提液中紫杉醇的测定.docxVIP

曼地亚红豆干杉叶片粗提液中紫杉醇的测定 紫杉醇是继阿霉素和铂之后的一种热点抗癌药物。它是世界上最具广谱性和活性的抗癫痫药物。就目前临床供药而言,紫杉醇的主要来源仍为天然红豆杉属植物。由于紫杉醇在树皮中的含量低,所以用自然来源方式来获取临床所需的紫杉醇,已给红豆杉属植物带来极大的威胁。曼地亚红豆杉是红豆杉科红豆杉属常绿针叶灌木植物,是一种天然杂交品种,其母本为东北红豆杉,父本为欧洲红豆杉。由于其生长速度快,4~5年生的曼地亚红豆杉树皮、枝叶中紫杉醇含量高于70~80年天然红豆杉树皮的紫杉醇含量;曼地亚红豆杉植株利用率高,全株均含紫杉醇,都可参与提取紫杉醇;具有生物量大、适应能力强、生物特性稳定等特点。曼地亚红豆杉已被美国FAD批准用于提取紫杉醇首选的红豆杉品种之一,如今国内大量引种该物种,因此原料易得。从曼地亚红豆杉枝叶中提取紫杉醇,不仅能改变天然红豆杉的濒危处境,具有影响深远的生物学意义,而且能产生巨大的经济效益。 本实验对曼地亚红豆杉枝叶的乙醇粗提液经过正己烷萃取,再经碳酸钾溶液碱洗两步处理,除掉粗提液中大部分杂质,使其纯度达到能进行HPLC检测分析的要求,而不致因杂质含量过高污染色谱柱,降低其使用寿命及影响分析。 1 实验部分 1.1 曼地亚红豆干叶的检测 紫杉醇对照品(购自中国药品生物制定所,纯度98%)、甲醇、氯仿、正己烷、碳酸钾、氯化钠均为分析纯;曼地亚红豆杉干枝叶由湘西本草制药责任有限公司提供。 BT8100型泵;K-2501型紫外检测器;CQ-6超声仪;N 2000双通道色谱工作站;Explorer全自动电子天平。 1.2 溶液的制备 1.2.1 对照品储备液的制备 精密称取紫杉醇对照品5.1 mg,以甲醇溶解并定溶于10 mL容量瓶中,制成510 μg/mL的紫杉醇对照品储备液。分别吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.00 mL对照品储备液,以甲醇定溶于5 mL容量瓶中,制成浓度分别为10.2,20.4,40.8,61.2,81.6,102 μg/mL的标准液,供绘制标准曲线时使用。 1.2.2 萃取-浓缩法 精密称取5.000 0 g曼地亚红豆杉干枝叶粉末,加入100 mL无水乙醇,冷浸过夜,超声处理40 min,静置过滤,滤渣再以100 mL无水乙醇超声30 min,静置过滤,合并滤液,于45℃真空浓缩至18 mL左右,加入2 mL蒸馏水,以50 mL正己烷萃取,再以25 mL 正己烷萃取2次。乙醇相于45℃真空浓缩至无醇,浓缩物以50 mL氯仿充分溶解,加入50 mL 1 mol/L碳酸钾溶液(含5%氯化钠)搅拌20 min,静置分层,氯仿相再以25 mL该碳酸钾溶液洗涤2次。氯仿相转移至50 mL容量瓶,并以氯仿定容,作供试品溶液。 1.3 流动相-甲醇-水法 色谱柱: phenomenex C18(250 mm×4.60 mm,5 μm),甲醇-水(65∶35) 为流动相,流速0.7mL/min,检测波长227 nm,柱温25 ℃。采用外标峰面积法进行定量分析。 2 结果与讨论 2.1 标准曲线的建立 以系列浓度对照品溶液按色谱条件进行操作,定量进样6 μL,测得紫杉醇浓度Y与浓度X的回归方程为:Y=2 325.8+4 853.4X(R=0.9 993,n=6),表明紫杉醇在10.2~102 μg/mL范围内具有良好的线性关系,标准曲线见图1。 2.2 对照品溶液的测定 同一天内每隔1 h及隔日于同一时间测定浓度为10.2,40.8,81.6 μg/mL的对照品溶液共5次,用标准曲线计算含量。结果:日内相对标准差(RSD)为:1.75%,1.22%,1.34%;日间相对标准差(RSD)为:1.81%,1.16%,1.47%。 2.3 加样回收率试验 精密称取5.000 0 g曼地亚红豆杉干枝叶粉末6份,分别定量加入紫杉醇对照品,制成样品溶液,测定峰面积,计算加样回收率,结果平均加样回收率为94.60%,RSD为1.28% (n=6),结果见表1。 2.4 进样精密进样 供试品溶液经0.45 μm微滤膜过滤,按色谱条件精密进样6 μL,其结果见图2、图3。 紫杉醇出峰时间为24.338 min,对同一批样测定5次,其平均含量为0.012%,RSD为1.46%。 2.5 其他条件下的实验 2.5.1 紫杉醇粗提液碱洗 在碳酸钾溶液第2次碱洗时,常发生严重的乳化现象,在碳酸钾溶液中加入5%氯化钠即可消除乳化。 2.5.2 曼地亚红杉树干枝叶的粉末提取 经2次提取,可认为紫杉醇已提取完全,因在第3次提取液中按本文操作检测未检出紫杉醇。 2.5.3 波长选择 经扫描,紫杉醇在紫外227 nm处有最大吸收,故采用227 nm为检测波长。 2.5.4 流量相的选择 采用甲醇-水(65∶35)体系作为流