差速离心法结合密度梯度离心纯化小鼠肝线粒体的研究.docxVIP

差速离心法结合密度梯度离心纯化小鼠肝线粒体的研究 线条是细胞的一个重要细胞器，是产生能量的重要场所。对细胞提供超过90%的ap，这在细胞活动中起着非常重要的作用。人类很多疾病的发生与线粒体的功能异常有着密切的联系,线粒体功能障碍在疾病发病过程中起着重要作用。随着线粒体研究的深入,线粒体的分离方法也不断改进。使用常规的差速离心法提取线粒体,虽然能够快速分离线粒体,但分离的线粒体含有大量的杂质。吴媛等比较了差速离心法与几种线粒体分离试剂盒的分离效果,发现虽然这些分离方法速度较快,但均含有大量的胞浆蛋白。差速离心获得的线粒体所含的杂质主要来自胞浆蛋白和内质网。目前纯化线粒体的方法大多是差速离心结合密度梯度离心,差速离心得到的粗提线粒体通过蔗糖密度梯度的纯化,杂质蛋白含量已大幅下降,但还含有一部分。本实验尝试采用两步纯化,对第一次蔗糖密度梯度纯化得到的线粒体进行第二次纯化,以提高线粒体纯度。通过透射电镜与免疫印迹检测,我们发现两步法得到的线粒体纯度明显高于前两者,增加的离心步骤对线粒体的得率及时间耗费影响有限。同时,线粒体膜电位以及琥珀酸脱氢酶比活测定结果显示,虽然延长了实验时间,但线粒体活力并没有受到明显影响。因此,只要增加一次非线性密度梯度离心操作,就可以有效提高线粒体纯化纯度,利于进一步实验的开展。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 实验材料 8周龄B6小鼠(温州医学院