临床免疫学：免疫诊断技术完整版.pptVIP

荧光素标记的单抗直接染色 操作简便 背景染色低 直接免疫荧光染色 间接免疫荧光染色 荧光素标记的第二抗体 未标记的第一抗体 灵敏度高 操作复杂 背景染色增加 10 3 10 4 10 1 10 2 10 0 10 3 10 4 10 1 10 2 10 0 10 3 10 4 10 1 10 2 10 0 number of cells CD3 CD4 CD8 单色免疫荧光染色 双色免疫荧光染色 染色方法 第一，表面染色 第二，胞内染色 第三，胞内和表面标记同时检测 荧光染料的种类及荧光光谱 FITC（异硫氰酸荧光素）：绿色，530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色，575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色，675nm PI(碘化丙啶）：橙红色，620nm APC(别藻兰蛋白）：红色，660nm 荧光染色对照的设置 阳性对照：以阳性细胞（用于检测的单抗所针对特异性抗原的细胞）为对照 同型对照：以同一亚型的免疫球蛋白为对照 最常见的抗体的亚型： IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM 3）检测的一般步骤 设置检测方案（PROTOCOL) 染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体） 同型对照管调电压 电压不变，补偿管调补偿 电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果 4）流式细胞术在免疫学中的应用 淋巴细胞亚群（T，B，NK） 活化的淋巴细胞（活化标记） 有功能的淋巴细胞（分泌细胞因子） 抗原特异性淋巴细胞 调控性免疫细胞 抗原递呈细胞 先天免疫细胞 嗜碱性粒细胞 CTL细胞 CD8 Treg细胞 CD4CD25 FoxP3 Th1细胞 CD4 / IFN T细胞 CD3 Th2细胞 CD4 / IL-4 Th17细胞 CD4 / IL-17 ①外周血淋巴细胞亚群检测 普通型态学检查不能 区分，流式最方便。 侧向散射光SS 前向散射光FS 淋巴细胞 单核细胞 嗜碱细胞 粒细胞 全血细胞裂解时的散射光 嗜酸细胞 嗜中性细胞 CD4+T细胞 CD8+T细胞 总T细胞（CD3+） 白细胞的精细分析：5色6个标记区分多种白细胞亚型。 对照 CD3：97％ CD8：95％ CD25：65％ CD45RO：67％ CD62L：55％ 治疗细胞 活化 活化 结合 杀手 ②HIV感染患者CD4阳性T细胞的绝对计数 HIV入侵人体的目标细胞是CD4阳性T细胞，感染后期能严重破坏T细胞，引起CD4细胞的减少 CD4阳性T细胞的计数是诊断、疗效观察和预后的最重要指标 CD4阳性T细胞绝对数量如果低于200细胞/ul，表明疾病将进入重症期 Flow-Count微球 绝对计数值 相对计数值 蛋白表达强度 CD4+ T细胞 总 T细胞 艾滋病人CD4细胞 ③CD34+造血干细胞计数 临床应用：骨髓移植供体骨髓或外周血造血干细胞计数 应用范围：骨髓移植手术供体造血干细胞采集准备，骨 髓库，干细胞相关研究等 CD34：0.31% ④强直性脊柱炎（AS）的诊断 临床诊断AS的三个主要依据： 临床症状：腰痛 X-ray：骶髂关节融合 免疫：HLA-B27阳性 可以作为任何腰痛患者鉴别诊断 HLA-B7/HLA-B27双标记优于单标记之处：消除了 由于正常HLA-B7与抗HLA-B27抗体之间的交叉反 应造成假阳性的可能 强直性脊椎炎支持诊断 HLA-B27真正表达，支持 HLA-B27和HLA-B7交叉反应，不支持 ⑤血小板测定 流式细胞仪是血小板计数的最准确平台，国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH) 在2001年就向全世界推荐 灵敏度高 (1- 400x109/L)， 重复性好，室内/室外变异系数均很小 尤其应用于血小板预输注病人的检测 出凝血疾病检测 正常血小板 CD41,CD42,CD42b,CD61?95% CD62P,CD63?3% 凝血酶活化血小板(糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂蛋白血症、脑血栓形成短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化） CD42a ??, CD42b ?? CD62p ??, CD63 ?? 血小板自身抗体引起的血小板减少 血小板黏附检测（粒细胞，单核细胞) 外周血血小板活化（CD62p/CD63）的检测 ⑥白血病分型 免疫标志能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。 白血病细胞无特异性标记，是干祖细胞在分化过程被阻滞在某一特定阶段，表现为不正常的比例、不正常的抗原表达、不正常的抗原表达时间等。 正常造血各系列细胞