生化实验报告-黎骅.docVIP

PAGE PAGE 26 生物化学实验报告 姓名：黎骅 日期：2010.9-10 生物化学实验报告 实验一：蔗糖酶的提取 一、实验基本原理 1、酵母细胞破碎：本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 2、蔗糖酶的初步分离纯化：蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。 （由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。） 二、实验材料与试剂 1、实验材料：市售干酵母粉 10g/组(3～4人） 2、实验试剂：⑴ 石英砂，⑵ 95% 乙醇(-20℃），⑶ 三、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；4、托盘天平（离心管平衡用）；5、高速冷冻离心机；6、恒温水浴箱（50℃）；7、制冰机；8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ；9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ；10、－20 四、实验操作方法和步骤 分组操作：本组2人。 1、酵母细胞破碎 可采用两种方法之一：干磨法和湿磨法。 本实验采用干磨法： 称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲 液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）；另留1ml上清液（样品I ） 2、热处理： 将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存， 五：实验结果 样品1体积：V1=32.4ml 样品2体积V2=28.8ml 实验二：离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 一、实验基本原理 1、离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。（离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。） 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 二、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)；⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；⑶ 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液(学生自配）；⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ；⑸ 5%蔗糖溶液 ；⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂。 三、实验器材与仪器 1、高速冷冻离心机；2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）；3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）；