蛋白修饰研究策略分析（四）丨蛋白修饰相关的蛋白功能分析.docxVIP

蛋白修饰研究策略分析（四）丨蛋白修饰相关的蛋白功能分析 我们除了要对蛋白修饰进行检测，还要把蛋白修饰与蛋白功能结合起来进行分析才能真正阐明蛋白修饰对蛋白功能的影响。下面我们介绍一下与蛋白修饰分析有关的常见策略和方法。 1.对蛋白修饰位点的氨基酸进行点突变 磷酸化修饰常常发生的氨基酸残基包括丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）和酪氨酸（Tyr，Y）。对于氨基酸位点的突变，以氨基酸的结构、空间位阻和电荷的相似性或差异性为基础，一般遵从下列规律：制备功能失活型突变体，常常会把原来的氨基酸残基替换为结构差异比较大的氨基酸残基。例如，会把丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）突变为丙氨酸（Ala，A），而把酪氨酸（Tyr，Y）突变为苯丙氨酸（Phe，F）。在命名和标记上会用原来的氨基酸名称+氨基酸位点数字+突变后的氨基酸名称来表示，如S312A，代表把某一个蛋白的第312位Ser突变为Ala。而制备功能组成型激活突变体，会把Ser、Thr或Tyr突变为一些酸性氨基酸，如谷氨酸（Glu，E）或天冬氨酸（Asp，D）。 在研究泛素化修饰的时候，大多数都要制备功能失活型突变体，而泛素常常偶联的氨基酸残基是赖氨酸（Lysine，K），按照氨基酸突变的规律，常常会把可能被泛素化的潜在目的蛋白的赖氨酸（Lysine，K）位点突变为精氨酸（Arginine，R）。而在进行多泛素偶联的研究时，会利用泛素表达载体、泛素连接酶表达载体以及被泛素化的潜在目的蛋白表达载体（分别带有不同标签）进行过表达后进行免疫沉淀和免疫印迹分析，这时常常会考虑泛素之间的连接位点，如K48位多泛素连接，就会在构建泛素表达载体时，把泛素短肽当中除K48位以外的所有其他赖氨酸位点都突变为精氨酸，我们把这种表达载体为泛素化位点特异性表达载体，类似的位点特异性表达载体还有K63、K11、K27、K29等不同位点特异性泛素表达载体。当然，也会只单单把泛素短肽当中可能进行多泛素化连接的位点（如K48、K63、K11、K27、K29等不同位点）突变为精氨酸（Arginine，R），以干扰在这个位点进行多泛素化连接，这样就可以更清楚某一个位点进行多泛素化连接的作用。这些不同类型的表达载体可以在很多商品化载体供应商（如Addgene等）订购到，可以大大节省大家构建的时间。 而在进行类泛素（SUMO）化修饰的研究时，会利用SUMO化表达载体、SUMO化连接酶表达载体以及被SUMO化的潜在目的蛋白表达载体进行过表达后进行免疫沉淀和免疫印迹分析。只是SUMO化又细分为SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4几种不同的短肽，并且也都分别有带不同标签的商品化表达载体供大家订购使用。 对于多种酰化（含乙酰、琥珀酰、丙二酰等）修饰，因为大多数酰化会偶联在蛋白的赖氨酸位点（Lysine，K），所以制备功能失活型突变体时，也同样会把原来的赖氨酸位点（Lysine，K）突变为精氨酸（Arginine，R）。 对于甲基化修饰，因为甲基化会偶联在蛋白的赖氨酸（Lysine，K）（赖氨酸可偶联单甲基化、二甲基化和三甲基化）或精氨酸（Arginine，R）（精氨酸可偶联单甲基化、对称二甲基化和非对称二甲基化）位点，所以制备功能失活型突变体时，也同样会把原来的赖氨酸位点（Lysine，K）突变为精氨酸（Arginine，R），而把精氨酸（Arginine，R）反而突变为赖氨酸位点（Lysine，K）。 对于糖基化，主要分为连接于天冬酰胺残基（常常位于Asn–X–Ser/Thr保守基序中）的酰胺氮原子的N-糖基化，连接于丝氨酸和苏氨酸残基的羟基氧的O-糖基化（与磷酸化不能同时发生），连接于磷酸化丝氨酸磷酸基的糖基化，以及相对较少见的连接于色氨酸残基碳的C-糖基化。在这里我们主要讨论前两种，N-和O-糖基化。制备功能失活型突变体时，会把N-糖基化连接的天冬酰胺位点（Asparagine，N）突变为谷氨酰胺（Glutamine，R），而把O-糖基化连接的丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）突变为丙氨酸（Ala，A）。 对于ADP-核糖基化（ADP-ribosylation），最初被发现连接于蛋白的一些酸性氨基酸位点，如谷氨酸和天冬氨酸。后来的一系列报道也发现了别的氨基酸位点，丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、磷酸化的丝氨酸等。 大家可以根据前面已经介绍的氨基酸位点的突变规律进行相应突变即可。 2.修饰相关酶类的干预 任何修饰偶联到蛋白质或从蛋白质上去除，都需要相应的酶类来实现。比如，磷酸化的添加需要激酶的作用，而磷酸化的去除需要磷酸酶的作用。其他的不同类型的修饰，也都有负责特异性添加和去除某种修饰的两大类酶。 修饰类型 负责添加修饰的酶 负责去除修饰的酶 磷酸化 激酶（如Akt，AMPK等） 磷酸酶