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犬瘟热诊断技术 1 范围 本文件规定了犬瘟热的临床诊断、病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR 检测、胶 体金试纸检测、荧光定量RT-PCR 检测、间接ELISA 检测的操作方法。 本文件适用于犬瘟热的诊断及其流行病学调查和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学 检测、RT-PCR 检测、胶体金试纸检测、荧光定量RT-PCR 检测、间接ELISA 检测适用于犬瘟热的实 验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文 件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂和材料 4.1 除有特殊说明，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验 方法中一级水的要求。 4.2 改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配制参见附录A 。 4.3 非洲绿猴肾细胞(Vero细胞) 。 4.4 磷酸盐缓冲液(PBS)：配制参见附录A 。 4.5 青链霉素：配制参见附录A 。 4.6 CDV 阳性血清：中和抗体效价1:1024。 4.7 CDV 阴性血清：无CDV感染的犬血清。 4.8 酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA) 。 4.9 底物溶液：配制参见附录A 。 4.10 过氧化氢甲醇溶液：配制参见附录A 。 4.11 盐酸酒精溶液：配制参见附录A 。 4.12 胰蛋白酶溶液：配制参见附录A 。 1 4.13 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5 U/μL，-20 ℃保存。 4.14 逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50 U/μL，-20 ℃保存。 4.15 RNA酶抑制剂(40 U/μL) ：-20 ℃保存。 4.16 dNTP ：含dATP 、dGTP、dCTP、dTTP各10 mmol/L，-20 ℃保存。 4.17 随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50 μmol/L，-20 ℃保存。 4.18 DEPC水：自配(参见附录A)或购买商品化DEPC水。 4.19 Trizol试剂：4 ℃保存。 4.20 异丙醇：使用前预冷至-20 ℃。 4.21 75% 乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至-20 ℃。 4.22 Premix Ex TaqTM （Probe qPCR ）。 4.23 1.5 mL无RNA酶的Eppendorf管。 4.24 0.2 mL无RNA酶的PCR薄壁管。 4.25 犬瘟热病毒胶体金抗原检测试剂盒。 5 器材和设备 5.1 细胞培养瓶(中号瓶) 5.2 二氧化碳培养箱 5.3 恒温水浴箱(5℃~100 ℃) 5.4 普通光学显微镜 5.5 0.45 μm微孔滤膜 5.6 离心机 5.7 PCR扩增仪 5.8 水平电泳仪 5.9 40个小孔的室玻片 5.10 冷冻切片机 5.11 高速台式冷冻离心机：可控温至4 ℃，离心速度可达12000 g以上 5.12 凝胶成像系统 5.13 荧光定量PCR扩增仪 6 临床检查 6.1 流行病学特点 6.1.1 该病主要传染源为发病动物、隐性感染的带毒动物及其排泄物，其中眼、鼻分泌物、呼吸道及粪 便中病毒载量较高。 6.1.2 一年四季均可发生，但冬季、春季多发。 6.1.3 不同年龄、性别及品种的犬均可感染，但是1岁以下的犬最为易感。 6.1.4 可经垂直和水平方式传播，被污染的水、食物、环境等是CDV 的主要传染途径。 6.2 临床症状 6.2.1 病犬体温升高至40 ℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，有脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。 6.2.2 下腹部、大腿内侧可见米粒大小丘疹。 2 6.2.3 病后期CDV侵害大脑时出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。 6.3 病理变化