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绵羊痘和山羊痘诊断技术 1 范围 本文件规定了绵羊痘和山羊痘 （以下简称为羊痘）的临床诊断、病毒分离与鉴定、PCR 检测方法、 实时荧光PCR 检测方法、LAMP 检测方法、血清血中和试验、酶联免疫吸附试验的技术要求。 本文件适用于羊痘的临床诊断、实验室检测、流行病学调查以及检验检疫。 2 规定性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规定性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件： 3.1 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR ） 是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量， 以便进行结构和功能分析。。 3.2 实时荧光PCR （real-time PCR ） 是一种利用荧光信号、累积实时监测整个PCR进程的试验方法。 3.3 Ct值（cycle threshold） 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。 3.4 LAMP扩增 (loop-mediated isothermal amplification) 环介导的恒温扩增是利用 Bst 酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序 列周而复始形成有很多环状结构的茎环 DNA 混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从 dNTP 析 出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀。 3.5 酶联免疫吸附试验 ( enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA) 酶联免疫吸附试验是由酶分子与抗体分子共价结合形成酶标记抗体，此种结合不会改变抗体的免疫 学特性，也不影响酶的生物学活性。通过此种酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合， 1 当加入底物溶液后，底物可在酶作用下出现显色反应，此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，从而 通过底物的显色反应来判定有无相应的免疫反应。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件： PBS ：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline) DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid ） SPF ：无特定病原体(specific pathogen free) CPE ：致细胞病变作用(cytopathic effect) TCID50 ：半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose) 5 临床诊断 5.1 流行病学 绵羊痘和山羊痘分别由绵羊痘病毒 （Sheeppox virus，SPV ）和山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV ） 引起。绵羊痘病毒（Sheeppox virus ，SPV ）和山羊痘病毒（Goatpox virus ，GPV ）均属于痘病毒科 （Poxviridae ）、脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirdae ）、山羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus,，CaPV ）， 主要感染绵羊和山羊。羊痘最初是由个别羊发病，以后逐渐蔓延全群。本病主要通过呼吸道感染，病毒 也可通过损伤的皮肤或粘膜侵入机体。饲养管理人员、护理用具、皮毛产品、饲料、垫草和外寄生虫等 都可成为传播的媒介。本病主要在冬末春初流行，气候严寒、雨雪、霜冻、枯草和饲养管理不良等因素 都有助于本病的发生和加重病情。 5.2 临床症状 羊痘的潜伏期一般5 d~l4 d，感染初期表现为发热，体温超过40 ℃，精神、食欲渐差。经2 d~5 d 后开始出现斑点，先在体表无毛或少毛皮肤、可视黏膜上出现明显的小充血斑，随后在全身或腹股沟、 腋下、会阴部出现散在或密集的痘疹，进而形成痘肿，分典型痘肿和非典型痘肿。 a)