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犬细小病毒病诊断技术 1 范围 本文件规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR 检测、荧光定量 PCR 、胶体 金试纸检测的操作方法。 本文件适用于犬细小病毒病的诊断、鉴定及流行病学调查和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制 试验、PCR 检测、荧光定量PCR 、胶体金试纸检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文 件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂和材料 4.1 除有特殊说明，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验 方法中一级水的要求。 4.2 FK81细胞(猫肾细胞) 。 4.3 0.9%生理盐水：配制参见附录A 中A.1 。 4.4 1%猪红细胞液：配制参见附录A 中A.2 。 4.5 犬细小病毒阳性血清。 4.6 96孔“v”形微量反应板。 4.7 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5 U/μL，-20 ℃保存。 4.8 1.5 mL Eppendorf管。 4.9 0.2 mL PCR薄壁管。 4.10 dNTP ：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L，-20 ℃保存。 4.11 10%十二烷基硫酸钠：配制参见附录A 。 4.12 蛋白酶K贮备液：配制参见附录A 中A.4 。 4.13 5×TBE 电泳缓冲液：配制参见附录A 中A.6 。 1 4.14 2×SYBR Premix 。 4.15 犬细小病毒胶体金抗原检测试纸条：有国家批准的正式生产文号，批签发的合格产品。 5 器材和设备 5.1 PCR仪 5.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4 ℃、离心速度可达12000 g以上 5.3 水平电泳仪 5.4 凝胶成像系统 5.5 荧光定量PCR扩增仪 6 临床检查 6.1 流行病学特点 6.1.1 病犬和带毒犬是主要传染源，通过分泌物、排泄物大量排毒，经消化道、皮肤和黏膜接触而感染。 6.1.2 犬细小病毒四季均可感染，无明显季节性，但冬春两季发病率较高。 6.1.3 不同品种的犬感染无明显差异，纯种犬发病率明显高于杂交犬，且病死率更高。 6.2 临床特征 6.2.1 潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40 ℃以上，有粉红色黏稠血样物。 6.2.2 患犬首先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体；继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷 射状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜；后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味。 6.2.3 患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥，弹性降低。 6.3 病理变化 6.3.1 心脏表面有出血斑点，心肌常有条纹状变性，形成红黄相间的 “虎斑心”。 6.3.2 肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。 6.3.3 胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶， 易于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。 6.4 结果判定 若临床症状符合6.2.1或6.2.2且出现6.3.1或6.3.3的病理变化，则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床 症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。 7 血凝与血凝抑制试验 7.1 血凝试验(HA)的操作方法 7.1.1 除了特别规定外，本文件中涉及到的样品采集及处理操作方法符合NY/T 541 兽医诊断样品采 集、保存与运输技术规范的要求。 7.1.2 样品采集活犬的泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便 样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000 g离心15 min，收集上清液待检；口腔拭子、粪便拭子用少量生 理盐水浸润后，取上清液待检。