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hplc法测定木豆叶中牡荆苷的含量 木豆是科豆属的一种落叶灌木，主要分布在广东省南部的海南、云南、广西、贵州省、广东省和福建省、湖南省、四川省、江西省、浙江省和台湾等省区。木豆叶可用于治疗外伤、烧伤、褥疮、止痛、消肿、止血等, 其消炎止痛功效优于水杨酸。木豆叶中主要含有牡荆苷、异牡荆苷等多种黄酮类成分, 具有降血压、止痉挛、抗感染、抗菌、辐射保护以及清除自由基的作用。近年来, 已研制出了以牡荆苷等黄酮类化合物为有效成分的木豆叶成药, 用于治疗股骨头坏死, 取得了很好的疗效。本实验采用HPLC法对不同产地及品种的木豆叶药材中牡荆苷的含量进行了测定比较, 为控制木豆叶药材及其制剂的内在质量提供了依据。 1 仪器和试剂盒 1.1 sartornus万分之电子天平2s,cw 日本岛津高效液相色谱仪 (型号:LC-20A (UV/Vis) ) ;Sartorius 万分之一电子天平 (型号:BSA224S-CW) ;Sartorius 十万分之一电子天平 (型号:CP225D) ;数控超声清洗器 (型号:KQ5200DA) 。 1.2 试剂及其制备 甲醇 (天津市大茂化学试剂厂, 分析纯;德国 Merck 公司, 色谱纯) 、乙醇 (天津市大茂化学试剂厂, 分析纯) 、冰乙酸 (天津市大茂化学试剂厂, 分析纯) 、重蒸去离子水 (实验室制备) ;牡荆苷对照品 (购于中国药品生物制品检定所, 批号:111687-200602) ;木豆叶药材均由广州中医药大学中药学院赖小平教授鉴定为木豆Cajanus cajan(L.) Millsp的叶。 2 方法和结果 2.1 流动相、柱温度和进样体积 色谱柱:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) ;流动相:MeOH∶1%HAc (29∶71) ;流速:1.0 mL/min;柱温:40 ℃;进样体积:10 μL;检测波长:330 nm。 2.2 对照品溶液的制备 精密称取牡荆苷对照品1.01 mg 置于10 mL容量瓶中, 加入甲醇超声溶解并稀释至刻度, 摇匀, 得101 μg/mL的牡荆苷对照品溶液, 作为母液备用。将母液分别稀释至101、40.4、8.08、4.04、1.616、0.808、0.32、01616 μg/mL。经0.45 μm微孔滤膜滤过后, 作为对照品溶液备用。 2.3 供试品的制备 称取木豆叶干粉约3 g, 置于锥形瓶中, 加入体积分数为 65%的乙醇溶液 60 mL, 超声提取 30 min, 取出, 放置至室温, 用 65% 乙醇溶液补足减失的重量, 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 滤液作为供试品备用。 2.4 方法研究 2.4.1 加样线性回归 精密吸取对照品溶液, 按 “2.1”项下色谱条件进样, 记录峰面积, 以对照品溶液的峰面积为纵坐标, 以加入的对照品量为横坐标进行线性回归, 回归方程为:y=3229489.747x-3740.189244,r=0.9999;线性范围为0.0016～1.01 μg, 最低检测限为0.96 ng。 2.4.2 精密度和验证试验 选取对照品溶液高、中、低3个浓度, 重复进样5次, 以牡荆苷峰面积积分值为指标, 测定其精密度, 结果得平均RSD分别为0.46%、0.81%和0.10%。表明本实验方法精密度较高。 2.4.3 稳定性测定 精密吸取同一浓度对照品溶液10 μL, 分别于 0、2、6、18、24 h 进行测定, 记录峰面积, 结果表明对照品溶液在24 h内稳定性良好, 平均RSD=0.77%。 2.4.4 重复性测定结果 取同一批木豆叶药材5份, 按供试品溶液的制备方法制备样品溶液, 进行HPLC测定, 测得RSD%=0.56%, 结果表明方法重复性良好。 2.4.5 加样回收率和rsd 取已知含量的木豆叶供试品溶液, 加入一定量的牡荆苷对照品, 按供试品溶液测定方法操作, 计算回收率。加样回收率为96.52%, RSD=1.85%。结果表明, 本方法分析误差较小, 操作过程中损失少, 回收率高, 方法可靠。 2.5 样品测定 精密吸取供试品溶液10 μL进样, 按照色谱条件测定牡荆苷含量, 见表1。 3 讨论 3.1 检测波长的确定 取牡荆苷对照品溶液, 在200～400 nm扫描, 结果表明, 牡荆苷在267 nm和330 nm处均有最大吸收峰, 但在330 nm下峰形对称, 基线平稳, 所以本实验选定330 nm为检测波长。 3.2 流动相甲醇-1%醋酸的分离结果 由于牡荆苷属于黄酮类化合物, 在液相分析中容易产生拖尾, 因此在流动相中加入了少量醋酸, 起到了消除拖尾、改善峰型的作用。此外, 随着流动相中甲醇比例的增加, 各物质的保留时间明显缩短, 但分离效果变差, 选择甲醇-1%醋酸 (2