rp-hplc法测定猫豆中的左旋多巴.docx

rp-hplc法测定猫豆中的左旋多巴 猫豆是科豆科植物的李家豆。它主要分布在亚热带和亚热带，其主要有效成分是左旋多巴。左旋多巴是一种非蛋白质氨基酸,在临床上可用于治疗帕金森氏病、肝昏迷、骨折、神经痛等。文献报道了不同产地猫豆中左旋多巴的含量比较,然而对猫豆植株各部位左旋多巴的准确分布、左旋多巴在种子中的动态含量变化等并未见报道。经笔者调查发现广西东兰当地存在两个栽培种:白花猫豆和紫花猫豆。白花和紫花猫豆在当地呈混杂生长状态,其主要性状差别在于花的颜色,从种子上难以区分。因此,分别在广西东兰和广东广州建立种植基地,观察其种子、豆荚、花、叶、茎中左旋多巴动态含量变化,确定左旋多巴含量高的猫豆栽培种进行栽培推广。 1 测定仪器及方法 Waters 1525高效液相色谱仪;Waters 717自动进样器;Waters 2487双波长紫外检测器;Breeze色谱工作站;SB25-12DTD超声波清洗仪(功率600 w,频率40 HZ)Mettler Toledo AL204电子天平,Milli-Q Biocel超纯水机。 左旋多巴对照品(广西东兰河丰药厂提供),经测定纯度大于99.5%,甲醇为色谱纯,液相用水为超纯水,提取用水为双蒸水,乙醇、醋酸、磷酸、磷酸二氢钾为分析纯。 猫豆采自广西东兰县种植基地和广州白云区种植基地,经中山大学药学院生药与天然药化实验室杨得坡教授鉴定为Mucuna pruriens(Linn.) DC. var.utilisBurck。 2 方法和结果 2.1 色谱条件分析 色谱柱:Varian Polaris RP-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);甲醇:0.01 mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲液(10∶90,pH3.38)用于分析种子、花、叶、茎(色谱条件1),甲醇:0.01 mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲液(5∶95,pH3.17)用于分析豆荚(色谱条件2);进样量:20 μL,流速:1 mL/min,柱温25℃,检测波长280 nm。在上述条件下,供试品溶液中左旋多巴色谱峰分离良好。色谱条件1下左旋多巴保留时间为3.96 min,色谱条件2下左旋多巴保留时间为4.50 min,理论塔板数以左旋多巴峰计不低于2 500,色谱图见图1。 2.2 对照溶液的制备 取左旋多巴对照品50 mg精密称定,加流动相溶解并定容至50 mL量瓶中,摇匀,得1 mg/mL左旋多巴对照品储备液。 2.3 超声处理条件 精密称取0.1 g猫豆粉末(80目)置于15 mL离心管中,加入0.1 mol/L 醋酸:95%乙醇(10∶1(v/v)) 10 mL,超声处理20 min,4 000 r/min,5 min,上清液经0.2 μm微孔滤膜滤过,按上述色谱条件进样分析。 2.4 标准曲线的绘制 精密吸取左旋多巴储备液5,2,1 mL,分别置于10 mL量瓶,用流动相稀释至刻度,摇匀,得到0.5,0.2,0.1 mg/mL的工作溶液;精密吸取左旋多巴储备液2.5,1,0.5置于50 mL量瓶,稀释至刻度,摇匀,得0.05,0.02,0.01 mg/mL工作溶液;从0.5,0.2,0.1 mg/mL标准溶液中精密吸取0.5 mL置于50 mL量瓶,稀释至刻度,摇匀,得0.005,0.002,0.001 mg/mL的工作溶液。10种浓度的左旋多巴对照品溶液分别按色谱条件1和色谱条件2进样20 μL,测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,左旋多巴的浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,得色谱条件1回归方程:Y=1.567×107-1.252×104(r=0.999 9),线性范围为0.001～1 mg/mL;色谱条件2回归方程:Y=1.512×107+2.667×104(r=0.999 9),线性范围为0.001～1 mg/mL。 2.5 峰面积、峰面积及峰层内风分布 取同一对照品溶液(0.05 mg/mL)按上述色谱条件,重复进样6次,测得色谱条件1下峰面积分别为810 550,812 281,809 469,812 400,818 295,816 851,平均峰面积为813 308,RSD=0.4%;色谱条件2下峰面积为 826 021,832 168,838 918,832 452,830 557,842 498,平均峰面积为833 769,RSD=0.7%。 2.6 左旋多巴含量测定结果 取同一批猫豆和猫豆荚样品6份,精密称定,按供试品溶液的制备方法操作,分别在色谱1和色谱2条件下分析测定,测得色谱条件1下猫豆种子中左旋多巴含量分别为5.95%,6.09%,5.78%,5.71%,5.61%,5.80%,平均含量为5.82%,RSD=2.9%;色谱条件2下猫豆荚中左旋多巴含量分别为0.37%,0.38%,0.37%,