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hplc法同时测定杜仲皮中4种有效成分 杜仲子牙又称四叶树，是中国特有的中药。它被列为国家二级保护树种。杜仲具有调节血压血脂、降低血糖、补肝益肾、抗毒抑菌等药理作用。杜仲的主要化学成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖、氨基酸等有机化合物,其中京尼平苷酸和京尼平苷属环烯醚萜类化合物,是由植物中臭蚁二醛衍生而来的一大类天然产物,具有保肝利胆、抗肿瘤、降低血压的功效;松脂醇二葡萄糖苷属木脂素类化合物,是一类在生物体内由双分子苯丙素生物聚合而成的化合物,具有降血压的功效,且降压作用持续、平稳、无不良反应;绿原酸属苯丙素类化合物,是形成木脂素的先导化合物,抑菌活性强。 国内外学者对杜仲药材活性成分分析检测研究报道较多,但是大部分文献根据《中国药典》2010年规定,偏重于测定杜仲叶中绿原酸或杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷量。现代植物化学研究表明不同活性成分在杜仲叶、皮分布差异较大,为更好地评价与开发我国杜仲药材资源,使其天然活性成分在药品、健康制品应用领域得到充分的发挥和利用。本实验以杜仲皮为研究对象,建立HPLC法同时测定杜仲皮中木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类三大类化合物京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷4种主要组分,为有效控制杜仲药材的质量提供准确、迅速的检测方法,并为后续产业化标准建立提供依据。 1 设备和材料 1.1 色谱数据工作站 高效液相色谱仪(岛津LC—10ATVP),LC solution色谱数据工作站;4504MP电子天平(万分之一);超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司,KQ3200B型,功率为150 W);纯水机(Thermo Fisher公司,DIamond TII型)。 1.2 试剂:乙腈或称乙腈 京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品购于北京北化恒信生物技术有限公司(质量分数均≥98%);乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司),其余试剂均为分析纯(天津科密欧化学试剂有限公司),水为超纯水;不同产地样品购于江西樟树药材市场,经湖南农业大学生物技术学院朱卫平副教授鉴定为杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮,60℃烘干、粉碎过20目筛备用。 2 方法和结果 2.1 对照品溶液的制备 精密称取京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品置棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,得到京尼平苷酸0.041 mg/m L、京尼平苷0.037 mg/m L、绿原酸0.048 mg/m L、松脂醇二葡萄糖苷0.036 mg/m L混合对照品溶液,4℃保存备用。 2.2 供试品溶液的制备 准确称取杜仲皮药粉1.0 g置50 m L锥形瓶中,加入25 m L 60%甲醇超声提取40 min,冷却定容至50 m L,摇匀过0.45μm滤膜,取续滤液,即得供试品溶液。 2.3 流动相a-1%磷酸溶液b的制备 色谱柱:Kromasil C18柱(200 mm×4.6 mm,5μm);柱温30℃;进样量5μL;流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱,0~7 min,7%A;7~35 min,14%A;35~45 min,15%A。体积流量1.0 m L/min;检测波长235 nm,此色谱条件下对照品与供试品分析图谱见图1。 2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品混合溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL,按照“2.3”项色谱条件进行分析,测定峰面积。以各对照品进样质量(μg)为横坐标(X),其峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得到京尼平苷酸的回归方程为Y=52 270 X+5 037,r=0.999 9,线性范围0.102 5~0.512 5μg;京尼平苷的回归方程为Y=44 531 X+3 329.4,r=0.999 9,线性范围0.092 5~0.462 5μg;绿原酸的回归方程为Y=76 580 X+7 788.8,r=0.999 6,线性范围0.120 0~0.600 0μg;松脂醇二葡萄糖苷的回归方程为Y=27 193 X+9 373.7,r=0.999 8,线性范围0.090 0~0.450 0μg。 2.5 京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷峰面积 精密吸取同一混合对照品溶液5μL,连续进样6次,记录京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷峰面积,RSD分别为1.70%、1.13%、1.95%、1.67%。 2.6 抗起酸含量的测定 精密称取同一批次杜仲皮样品5份,每份1.0 g,依“2.2”项制备得供试品溶液,测定京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面积,计算质量分数,RSD分别为1.17%、1.45%、2.04%、1.54%。 2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5μL,分别于0、2、4