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sds抽提法提取蔗糖酶工艺的研究 0 ec3.2.1糖的制备 葡萄糖母亲也被称为营养储备。它是科和写诗糖的繁殖科。它可以用作食物、药物和饲料。此外，还可以提取氨基酸、谷胱甘醇、葡萄糖酶和细胞色素c等养分。蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26),又称为转化酶(Invertase),属于水解酶类,蔗糖在蔗糖酶的催化下,水解为两种还原糖D-葡萄糖和D-果糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用,并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。 本实验采用SDS抽提法从啤酒酵母中提取蔗糖酶,通过正交实验对SDS浓度、提取时间、PH值、提取温度等条件进行优化,采用离子强度递增的方法用Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换层析方法得到纯化的酵母蔗糖酶,并对酶性质进行研究。 1 实验方法 1.1 精密检测仪器 TU-1810紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;THZ-82A台式恒温振荡器:上海跃进医疗器械厂;SHZ-B水浴恒温振荡器:上海跃进医疗器械厂;BSZ-100自动部分收集器:上海青浦西仪器厂;TGL-16G型高速离心机:上海精密科学仪器有限公司;Q Bio-Sep FF:北京生科瑞达科技发展有限公司。使用试剂均为分析纯。 1.2 菌株收集方法r/min 啤酒酵母来自某啤酒厂。啤酒酵母离心(7000r/min)15min收集菌体。将收集到的菌体用蒸馏水洗涤,离心,洗涤,数次,直到菌体呈白色,倾出上清液,将不含杂质的干净的酵母保存待用。 1.3 粗制酶液的制备 准确称取离心分离后酵母10g,加入60m L0.6mmol/L的SDS溶解,p H5.5,40℃水浴12h后取出,4℃、10000r/min离心20min,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。 1.4 绘制标准曲线 以葡萄糖含量为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,获得线性回归方程。直线方程为:Y=0.5528X+0.0116,回归系数为0.9983。 1.5 绘制标准曲线 以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,获得线性回归方程。回归系数为0.9996,直线方程为:Y=0.0080X+0.0261。 1.6 酶缓冲溶液及naac-hac缓冲液的反应 葡萄糖和果糖具有还原性,可与3,5-二硝基水杨酸共热后还原成棕红色物质,在一定范围内,葡萄糖的含量和反应液的颜色强度成正比例关系。稀释酶液0.5m L,加入0.3m L p H 4.6、0.1mol/L的Na Ac-HAc缓冲液,0.2m L 0.1mol/L的蔗糖,37℃准确反应15min,后加0.125m L 1mol/L的Na OH中止反应。在该条件下,蔗糖酶液1min转化底物蔗糖生成1μg葡萄糖为定义为1个活力单位,用DNS法在540nm波长下测定形成的还原糖量。 1.7 添加0.2%乙醇-双蒸液法 在提取出的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达30%,4℃放置过夜,4℃、10000r/min离心15min,,取上清液,再追加乙醇使其终质量分数达50%,4℃放置1h,4℃、11000r/min离心15min,弃上清液,沉淀用双蒸水溶解,4℃保存。 经SDS抽提法提取,质量分数50%的乙醇沉淀所得的酶液用透析法(p H 7.3、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液)充分透析,所得透析液4℃保存。 1.8 糖酶的纯度 采用Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱层析纯化粗酶液。 2 结果与分析 2.1 正交试验结果 在单因素试验的基础上,选取SDS浓度、p H值、提取温度、提取时间考察其对酵母蔗糖酶抽提效果的影响,采用四因素三水平正交表L9(34),做正交试验。因素及水平的设计见表1,正交试验结果见表2。 通过正交实验表可知:比较四个因素的极差,对提取效果影响大小依次为:ACDB,最佳工艺条件为A2C3D1B2。即SDS浓度0.6mmol/L,温度50℃,时间10h,p H5.0,此条件下提取效果最佳。 2.2 蔗糖酶活性测定 将SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制酶液经质量分数50%的乙醇沉淀,溶解透析后,过Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱。 经酶活性和蛋白质含量测定,表明此峰具有蔗糖酶活性,而且蔗糖酶活性和酶液的蛋白质含量成正比,为蔗糖酶活性峰。收集Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱层析后具有较高蔗糖酶活性的峰的各管流出液,真空干燥浓缩,得到纯化的酵母蔗糖酶,纯化曲线见图1,经过Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱层析后,SDS抽提法所得的蔗糖酶的纯化倍数是相应酶液的16.8倍。 2.3 关于母糖葡萄糖酶的性质研究 2.3.1 ph对酶活力和酶稳定性的影响 2.3.1. 1ph对酶活性的影响 测定了蔗糖酶在p H3~6之间的酶活力,p H为5.0时,蔗糖酶酶活力最高。p H超过5.