非洲猪瘟以及猪冠状病毒现场快速检测技术研究.pptxVIP

;; 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，可感染各个年 龄段的猪只，其中以强毒力毒株感染引起的高出血性和高致死率为特征，致死率可高达100%。 ASF的高传染性、高发病率和高死亡率，给我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济威胁。 2018年- 2019年，全球共销毁约3000万头猪，直接经济损失高达20亿美元。 至今，ASFV依然在全球范围内传播。; 冠状病毒是引起仔猪腹泻的重要病原，主要包括猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪 传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine delta corona virus ，PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus ，SADS-CoV)。 各种年龄猪都可发病，尤其是 3~10 日龄仔猪最易发病。感染猪均以呕吐、腹泻、脱水和肠道出血为主要特征， 且常常呈现隐性感染或多病原混合感染 ，给世界各地的养猪业均造成了巨大威胁。 PEDV和TGEV是目前分布最广的猪腹泻病毒性病原，对哺乳仔猪致死率可达100%； 在河南地区猪腹泻样本中， PDCoV阳性率达35.06%，与PEDV混合感染率达24.03%；SADS-CoV在2016年于我国广东首次发现。仅2017年 引起国内猪只死亡数达25000头。;; ? 非洲猪瘟以及猪冠状病毒的准确、快速诊断对于防止疫病的蔓延，快速扑灭和根除尤为重要。病 毒感染7-10天后可以检测到抗体，但通常急性的感染在猪只还未表现出明显症状时，就已死亡 ,首选核酸检测。 ? 病原学诊断 ：依赖于活病毒、抗原、基因组的检测，包括病毒分离，抗原ELISA ，荧光抗体检测 ， PCR等，目前荧光定量PCR检测使用较多。 ? 血清学诊断 ：猪感染非洲猪瘟以及猪冠状病毒后7-10天可出现抗体，而且抗体可以持续很长时 间，因为目前没有ASF、 PDCoV以及SADS-CoV疫苗，此方法针对亚急性和慢性的感染，适合 大规模的抗体筛查。;; ? 目前，猪病实验室诊断技术虽然能够提供精确的检测结果 ，但需要多种仪器设备 ，操作也比较复 杂 ，依赖专业技术人员在实验室里才能完成 ，难以适应病原快速诊断的发展要求。 ? 快速??断技术无需特殊仪器设备可肉眼判读结果 ，具有简便快速、特异性强、敏感性高 ，实验结 果易保存等优点 ，并且可以定性或半定量检测。同时快速诊断技术对试验设备要求低 ，便于在基 层养殖场实施，为基层兽医人员和猪场检测猪病的抗体、抗原提供便捷的检测手段。 随着快速诊 断技术的不断研究、发展及推广应用 ，将有效地促进猪重大疫病的检测与净化工作，对提高我国 养猪业生产的整体技术水平和公共卫生安全，发挥巨大经济与社会效益。; Ⅱ. 冠状病毒快检方法的研究进展;;;; Ⅲ. 非洲猪瘟快检方法的研究进展;;;;;; Ⅳ.本实验室冠状病毒快检方法; 一步法核酸提取技术 该方法主要是通过核酸释放剂实现样本中的核酸快速裂解释放 ，缩短核酸提取耗时 ，裂解产物可直接用于核酸检 测。该试剂能够常温保存，便于运输及储存。 采用该核酸释放剂能够使整个核酸释放的过程均在室温下进行，可 有效降低气溶胶的污染，能有效的保护实验操作人员的安全。该技术有着快速、安全、稳定、高效、成本低等明 显的优势。; 快速柱式核酸提取 使用了一种特殊修饰的玻璃纤维膜 ，玻璃纤维具有毛细纤 维结构 ，能吸附比同等纤维素滤纸以及硅载体更多的水分， 具有流速快、耐高温、纳污能力强的特点 ，并可以过滤细 小的颗粒。与传统的柱式核酸提取方式相比，该提取方式 的提取时间大幅度缩短，且所需的离心力更小（仅需瞬时 离心机即可完成） ，操作方便，可实现现场快速核酸提取 和纯化。;; 快速变温扩增技术 在传统变温扩增技术的基础上，我们对PCR仪以及检测试剂 进行了改进，实现了快速升温降温，同时Taq 酶的合成速率 变高，使扩增时间进一步缩短。; 冷冻干燥技术 本研究采用该技术将试剂进行脱水干燥，可实现试剂的常 温运输和保存。通过液氮塑形和赋形剂的作用，可使冻干 试剂呈现规则球状，能够实现冻干试剂从冻干容器至试剂 包装（如PCR管、 EP管、扩增杯、芯片试剂存储腔等）的 转移。临床操作人员仅需加入适当的样本，即可快速进行 PCR反应，避免了繁琐的人工操作步骤可能带来的误差及 交叉污染。; 超快速P