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牛胚胎移植的技术要点 1 胚胎移植的操作环节 主要包括选择母乳喂养的母乳喂养牛、超数个母乳喂养牛、同一体和受体的母乳喂养牛、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存、胚胎移植、受影响脊柱的妊娠诊断等。要提高牛胚胎移植的成功率,就要从以上各个环节着手,切实做好各项工作。 胚胎移植的操作原则:移植中必须遵循移植前后所处环境的同一性。包括:生理上的一致性,即供体和受体牛在发情时间上的一致性和解剖部位上的一致性,即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境的相似性。胚胎发育的日龄必须与受体发情排卵期的日龄相一致。 胚胎采集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命。因此,通常在供体发情配种后3～8日内收集胚胎和进行移植。移植的胚胎必须经过鉴定,证明是发育正常者。在全部操作过程中,胚胎不应受到任何不良因素的影响。 开展胚胎移植必须要有充足的胚胎来源,且质量好。 1.1 体牛选择 1.1.1 优良品种 供体牛要符合本品种标准,血统、体型外貌和生产性能优良,具有早熟性和长寿性,且遗传性稳定、谱系清楚,无遗传缺陷。 1.1.2 传染病、传染病、产菌障碍 供体牛要体质健壮、肢蹄强健、繁殖机能正常,无遗传病、传染病、难产、流产和繁殖障碍。发情周期不明显的牛、患子宫内膜炎或长期空怀母牛,都不能作为供体。 1.1.3 年龄合适 1.1.4 繁殖品质优良 具有较高的繁殖力,生殖器官正常,发情周期正常,受胎性好,受胎率及配种指数较好,连续一年产一犊。 1.1.5 优越性 母牛生殖器发育良好,对超数排卵要有良好的反应,且排卵数多,采得的受精卵质量良好。 1.1.6 温顺 要选择性情温顺的母牛作为供体。 1.2 超排、注射促性腺激素 在母牛发情周期的适当时间,注射促性腺激素,使卵巢中有较多的卵胞发育和排卵,这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体母牛作超数排卵处理,以便一次取得多枚胚胎。一般认为超排量最好是10个左右,太少会降低胚胎移植的意义,同时胚胎的收集也有困难,超排过多会降低卵子的受精率和收集率。 超排处理一般方法为在预计发情到来之前4 d,即发情周期的第16 d注射促卵泡素或孕马血清促性腺激素,在出现发情的当天注射绒毛膜激素。 目前较常采用的几种超数排卵的方法为: 1.2.1 促其他素—促卵泡素+前列腺素F2a(一般用氯前列烯醇) 在发情后的第9～13 d进行,肌注促卵泡素50mg,肌注或子宫注入前列腺素F2α4～5 mg (子宫注入量减半)。促卵泡素处理采用递减法,以7 mg、6mg、5 mg、4 mg、3 mg递减,每日分上、下午2次注射,共连续注射5 d。在第3 d与注射促卵泡素同时注射前列腺素4～5 mg,第5 d下午进行第一次输精,第6 d上午做第2次输精。 1.2.2 患者注射前列腺素情况 用药时间同上,孕马血清促性腺激素肌肉注1 500～3 000 IU 48 h后,肌注或子宫注入前列腺素F2a 4～5 mg。输精时间在前列腺素处理后48 h,每隔10～12 h输精1次,共输2～3次。 1.3 冲卵液的采集和保存 利用冲卵液将早期胚胎从供体母牛的子宫角内冲出来,并收集于一定的器皿中。胚胎收集方法有手术法和非手术法两种。现普遍采用非手术法。一般在供体母牛发情配种后6～7 d内收集胚胎,胚胎处于致密桑椹期和囊胚期。此方法简便易行,对生殖道损伤的危险性小,收集效果比较好。 首先将供体牛保定,体位前高后低,便于操作和胚胎冲出。尾根处(第3～4尾椎)剪毛,酒精消毒,注射2%普鲁卡因2～3 mL或2%～4%盐酸利多卡因2～4 mL等进行尾椎硬膜外麻醉。如牛不安宁可肌注2%静松灵2～4 mL。直肠检查卵巢大小、子宫状况,估计黄体数量。清洗外阴部,用消毒液消毒。 非手术冲取胚胎所用的冲卵管有二路式和三路式,其不同之处是冲卵液注入和导出的管道,二路式是同一管道,而三路式则各有进出两个管道。另外两种冲卵管都有一注入空气的管道,使之冲卵时,可将子宫角内腔基部固定。导管用直肠把握法从子宫颈导入子宫角。通过气囊导管打入空气,使气囊膨胀以固定导管在子宫角内的位置和防止冲洗液倒流。冲洗液经单路管注入子宫角,然后将冲洗液收集在漏斗形容器内。但气囊充气应适度,每次15～50 mL,过于膨胀易损伤子宫内膜,过小则不能固定冲卵管,使子宫留有间隙,冲卵液由阴道流出。 一般每侧子宫角需冲卵液500 mL,冲卵液温度保持在37℃,冲卵液的导出应顺畅,进出液量要相当,冲洗5～6次。为更多地回收冲洗液,可在直肠内轻轻按摩子宫角。因此,操作时,可用手隔着直肠壁将子宫提高,促进液体回流。收集到的冲卵液,置于37℃无菌间待检。收集胚胎的冲卵液目前多采用改良的杜氏磷酸缓冲液(mPBS),此液可用于冲洗胚胎,也可用于胚胎的保存液和培养液。配制方法简单,成本低,比较适用。 冲洗液多数为组织培养