植物生物技术2_实验一：无菌苗的制备与培养基的制备-华中农业大学课件.pdf

实验一无菌苗的制备与培养基的制备 一、实验目的 学习植物组织培养基本理论，通过亲自动手操作，掌握无菌培养的基本技能。了解植物 培养基的构成及配制方法。 二、原理 分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。 三、实验材料 棉花品种YZ1,棉花组织培养经典模式品种。 四、器具和试剂 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，0.1?汞溶液，琼脂，pH试纸， 移液管，MS培养基母液(见表一),2,4-D,KT(激动素),葡萄糖. 表一MS培养基母液 大量元素(20倍)母液(g/L) KNO? 38 NH?NO? 33 MgSO?·7H?O(无水MgSO?) 7.4(3.8) KH?PO4 3.4 CaCl?·2H?O9(无水CaCl?) 8.8(6.6) 微量元素(100倍)母液(g/L) CoCl?·6H?O 0.0025 CuSO?·5H?O 0.0025 H?BO? 0.62 KI 0.083 MnSO?4H?O 2.23 NaMO?·2H?O0.025 ZnSO?7H?O0.86 铁盐(100倍)母液(g/L) FeSO?7H?O2.78 Na?EDTA 3.73 Bs有机物 VB?(硫胺素) 10mg/L VB,(盐酸吡哆醇) 1mg/L VB。(烟酸) 1mg/L 肌醇 100mg/L 甘氨酸 2mg/L 生长调节剂 生长素(2,4-D、IBA、IAA、NAA等)细胞分裂素(KT、ZT等) 五、实验步骤与说明 (一)无菌苗的制备 将棉籽壳用手术剪刀去掉，用0.1??升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌 至四天暗培养，一至二天光照培养。 注意事项： 用剪刀去壳时，尽量保持胚的完好。 升汞浸泡种子时，要充分振荡溶液，使种子沉入液体中，利于种子与溶液充分接触提高灭 菌效果。 种子接种两天后，可将胚根插入到培养基中，扶正后的无菌苗容易笔直生长，利于后 续试验。 (二)培养基的制备 (1) 分别按配方逐个加入各种贮备液 MS大量元素(20倍) 50ml 微量元素(100倍) 10ml 铁盐 (100倍) 10ml 微生素 (1000倍) 1ml 肌醇 (100倍) 1ml 甘氨酸 (1000倍) 1ml 2,4-D (0.1mg/ml)1ml 激动素(KT)(0.1mg/ml) 1ml (2) 称出规定数量的琼脂(8g/L)和葡萄糖(30g/L)。 (3) 加蒸馏水直至最终容积(1L)。 说，植物组织培养适合的pH值为5.8,当pH高于6时，培养基将会变硬， 低于5时，琼脂就不能很好地凝固。 (5) 把培养基分装到所选用的培养容器中，每个100ml三角瓶约装50ml。用包在纱 布中的棉塞(它能阻止微生物污染，但可使气体自由交换),或其他适宜的 塞或盖封严瓶口。 (6) 把已装入了培养基的培养容器装在铁丝篮子里，外面包上一层铝箔以防止棉 塞在高压灭菌时吸湿，在121℃(1.06kg/cm2)下灭菌15min。 (7) 对于使用不能用高压灭菌的药品来讲，经过滤灭菌后的药液等到高压灭菌的 培养基冷却到大约60℃时，在超净工作台加入到培养基中，摇匀。可用恒温 水溶，以免培养基温度下降过快而凝固。 (8) 使培养基在室温下冷却，置冰箱中在4℃下保存。当用试管制备琼脂固化培养