原发性开角型青光眼患者房角组织内谷氨酰胺转移酶的表达.docxVIP

原发性开角型青光眼患者房角组织内谷氨酰胺转移酶的表达 由谷氨基丙烯酸酯（tg）生产的组织丙烯酸酯旋转酶（tg）是谷氨基酸转移酶家族的成员之一。它的作用主要有：(1)催化蛋白交联形成蛋白聚合物，这一作用是Ca2+依赖性的，并且可导致异肽键的增加，可高度抵抗机械和蛋白质水解的破坏，有显著的生理及病理学意义。(2)t TG是一种惟一存在于细胞溶质中的（谷氨酰胺转移酶transglutaminase,TG）家族成员，除了催化蛋白质的交联作用外，它还有结合并水解GTP和三磷酸腺苷的活性。因此t TG是个双功能酶。t TG分布广泛，在不同的组织细胞中，在细胞的不同部位发挥不同的作用，参与多种生理和病理过程。已有研究发现，t TG在眼内也有表达，并且在多种眼部疾病的病理生理过程中发挥重要作用，并且多种促纤维化因子(如TGF2β1、IL21等)均可刺激t TG的表达。开角型青光眼患者前房内和小梁细胞高表达转化生长因子-β（TGF-β）,可促进小梁细胞外基质的合成。本实验以开角型青光眼患者为对象，观察原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG），原发性闭角型青光眼（primary angle closure glaucoma,PACG）以及正常人的房角组织中t TG的表达差异。 1 材料和方法 1.1 含含含光血眼病例的患者 取得患者同意后，收集开角型青光眼患者26例，26眼。闭角型青光眼17例，17眼，且年龄均在24～45岁。收集病例均为原发性青光眼，无其他眼病，尚未发现其他系统疾病。来源于武汉市协和医院眼科青光眼手术中取出的组织。正常眼3例，来源于角膜移植术供体眼。 1.2 免疫组织化学 手术中取出的组织迅速放在10%的中性福尔马林溶液中固定，过夜。在梯度酒精中脱水，用等分的无水酒精和二甲苯透明，等分的二甲苯和石蜡混合浸透30 min，石蜡Ⅰ，Ⅱ各浸透2 h，石蜡包埋，切片。加入抗t TG抗体（由武汉晶美公司提供）用SP法进行免疫组织化学染色，加入SP试剂。37℃，30 min,DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，树胶封片。 1.3 pt-pcr检测方法 根据序列分析的结果合成t TG的引物，以β-actin作为半定量参照。 1.3.1 步骤1提取1g 将同一组的样本一起用匀浆器捣碎，应用Trizol试剂盒(美国Gibco公司产品)提取组织块中的RNA。 1.3.2 基于dntp的cdna 取蒸馏水8μl、随机引物2μl和5倍反应缓冲液8μl，脱氧核糖核苷三磷酸（d NTP)混合物为2μl(10mmol/L)，取RNA酶抑制剂20μl、逆转录酶10μl(美国Promega公司产品)和RNA10μl，于42℃水浴中反应30 min，制备cDNA。 1.3.3 pcr扩增条件及条件 (1)t TG引物均来源于上海生工。t TG引物序列：上游5′-CCT TAG TTG CCT ATG CTG A-3′，下游5′-CAG TGC TCG CTG TTT GTA G-3′，扩增后片段长度为433bp。(2)PCR反应体系：蒸馏水16.5μl，上下游引物各1μl,10倍反应缓冲液2.5μl,15mmol/LMgCl21.5μl,dNTP混合物0.5μl(10 mmol/L)，DNA聚合酶1μl(加拿大Sangon公司产品)，cDNA 1μl。阴性对照不加cDNA。(3)PCR扩增条件：95℃变性1 min,53℃退火40 s,72℃引物延伸40 s,30次循环。(4)产物观察与鉴定：扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，于紫外线箱中观察并照相记录。相对分子质量标准物，同时扩增产物纯化后送大连TaKaRa公司进行测序。 2 结果 2.1 u3000结语 开角型青光眼组免疫组织化学显微镜下可见到小梁细胞中、角膜基质中深褐色的点片状着色，位于细胞质内，异于色素颗粒。而闭角型青光眼患者及正常组的房角组织的免疫组织化学图片中，见整个房角组织着色少，胞质较透明。见图1。 正常组、闭角型青光眼组和开角型青光眼组房角组织t TG的表达免疫组化结果如下： 对免疫组织化学所的图片进行光密度分析：正常组光密度值为0.180±0.032,POAG组光密度值为0.325±0.052,PACG光密度值为0.012±0.019。进行方差齐性检验，证明方差齐。正常组与闭角型青光眼组房角t TG的表达差异并无显著性（P0.05），而正常组与开角型青光眼，闭角型青光眼与开角型青光眼之间差异有显著性（P0.01,P0.05）。 2.2 ttg/-actin的测定 RT-PCR产物电泳结果显示如图2，正常对照组、闭角型青光眼组和开角型青光眼组，将t TG/β-actin的灰度值相比较，其结果与免疫组化测试结果一致。 3 开角型光栅光管热tg t TG