堆肥样品DNA提取.docxVIP

3堆肥样品DNA提取 3.1堆肥样品的预处理 DNA提取前对所有样品进行洗涤。取堆肥样品1.0g于5ml离心管内，加入3mlTENPbuffer(50mmol-L-1Tris-HCl，20mmol-L-1EDTA，100mmol-L-1NaCl，pH=10.0)，充分涡旋2min，5000r/min离心10min，沉淀再次洗涤；沉淀加入3mL120mmolL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=8.0)，充分涡旋混合，5000r/min离心10min，洗涤直至上清液颜色较为澄清，沉淀用于后续研究。 DNA提取 采用改进的蛋白酶K-CTAB法进行。 1、在洗涤好的样品中加入1.5mLDNA提取液(100mmolL1Tris-HC1，pH=8.0，100mmol?L-1EDTA，pH=8.0，100mmol?L-1Na3PO4，1.4mol?L-1NaCl，2%CTAB)，剧烈振荡混匀后加入溶菌酶和蛋白酶K(均为10gL，100mg-mL-1)o 2、将混合好的样品置于37°C、225r/min摇床上摇动40min，加入200gL(10%)SDS，65°C水浴2h，每隔15-20min轻轻上下颠倒摇动。 3、沉淀在室温6000r/min下离心10min，取上清，转移至新的5ml离心管中，再加入0.5mLDNA提取液和50^(10%)的SDS，65C水浴10min，重复操作后，合并上清。 4、在获得的上清液中加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，轻轻颠倒30min混合。6000r/min下离心10min，吸取上清液转移至新的5mL离心管；同样操作3次，最大可能洗去多糖、蛋白质的污染。在上清液中加入0.6倍体积异丙醇室温沉淀1h，11000r/min下离心10min，弃上清。 5、沉淀以1ml冰预冷的70%乙醇轻微振荡洗涤，4C下以13000r/min离心3min；沉淀再以0.7ml冰预冷的无水乙醇再次轻微振荡洗涤，4C下以13000r/min离心2min。 6、沉淀自然风干，加入250应TE缓冲液溶解DNAo取6应进行电泳走样，确认粗提效果。将粗提得到的DNA置于-20C保存。 DNA的纯化 根据本实验堆肥的特点，采用北京天根生化有限公司生产的普通DNA产物纯化试剂盒纯化DNA，以期能够尽可能去除其中的各类杂质。由于堆肥中的杂质含量相比其他环境样品，杂质含量更高。因此，如果DNA纯化的方法能够有效的去除堆肥样品DNA，则也一定会适用于其他样品。此试剂盒采用独特的离心吸附柱纯化DNA片段，具有快速多样高效等优点。操作步骤如下： 1、柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500gL平衡液BL，12000r/min离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。按照以上方法提取到的DNA为粗提的DNA，其中含有大量的其他杂质，如多糖、蛋白质、RNA，最主要的是含有酶促反应抑制剂腐殖酸类物质，因此，粗提DNA溶液还需要经过纯化，才能够用于PCR、DGGE等后续的分析。 2、估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。将所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800gL，若样品体积大于800gL可分批加入。 3、向吸附柱CB2中加入700应漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。 4、向吸附柱CB2中加入500应漂洗液PW，12000r/min离心1min，倒掉废液。 5、将吸附柱CB2放回收集管中，12000r/min离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 6、将吸附柱CB2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。12000r/min离心2分钟收集DNA溶液。样品使用前于-20°C保存。 3.41%琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。粗提和纯化过程之后，可以通过此方法来观察所提取DNA的效果如何。 其操作步骤为： 1、准