第三章第三节电泳技术演示文稿.pptVIP

支持介质放在两个支架上，其两端与电泳液接通而形成盐桥。通电后，电流只能在支持介质体上通过，电泳物质在其上泳动。绝缘盖起防止缓冲液蒸发以及防触电的保护作用。有些电泳槽有冷却装置以保证电泳介质的温度不至过高。 电泳操作一般有支持介质的制备或饱和，加样，电泳分离样品、染色及洗脱比色或光密度扫描定量等步骤。 本文档共65页；当前第30页；编辑于星期二\19点2分 第四节 几种常用电泳技术 本文档共65页；当前第31页；编辑于星期二\19点2分 一、醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate electrophoresis,CAE）是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是将纤维素的羟基乙酰化形成纤维素醋酸酯，然后将其溶于有机溶剂后涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。 该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120μm，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。 本文档共65页；当前第32页；编辑于星期二\19点2分 （一）优点 1．吸附作用和电渗作用都很小 2．分离速度快 3．分离区带清晰，分辨率高 4．样品用量少 5．操作简便 6．易定量、可长期保存 本文档共65页；当前第33页；编辑于星期二\19点2分 （二）缺点 1．薄膜吸水性差 2．分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低 3．不适于制备 本文档共65页；当前第34页；编辑于星期二\19点2分 【实验名称】醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质 【实验原理】 血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，纤维蛋白原６条区带。 （三）操作步骤 本文档共65页；当前第35页；编辑于星期二\19点2分 （三）操作步骤 处理膜→点样→电泳→染色→漂洗→透明→测定吸光度 本文档共65页；当前第36页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 1、薄膜准备 ①将醋酸纤维素薄膜切成2×8cm的小条。 ②在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。 ③在薄膜角上用铅笔作一标记。 ④将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。 本文档共65页；当前第37页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置 8cm 2cm 点样线 点样区 1.5cm (粗面） 本文档共65页；当前第38页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 2、电泳仪准备 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。 本文档共65页；当前第39页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 3、点样（电泳的关键步骤） 用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养皿的血浆中沾一下，再在膜条点样线处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血浆样品。 点样线尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。 本文档共65页；当前第40页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 4、上槽 待血浆吸入膜后，以薄膜粗面向下、点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。 切勿使点样处与电泳槽接触 本文档共65页；当前第41页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 5、电泳 检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电40~60min。 电压：110~130V（10V/cm膜长） 薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。 电流：0.4~0.6mA/cm膜宽 有数条膜便求数条膜宽的总和。 本文档共65页；当前第42页；编辑于星期二\19点2分 操作步骤 6、染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2~3次），至背景