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PCR的普通流程 （以Taq DNA聚合酶为例） 试剂和仪器 1、仪器：PCR仪、移液器、离心管和枪头（121℃灭菌20min，烘干）、冰盒、板架、离心机。 2.ddH2O：三蒸水121℃灭菌20min，4℃保存； 3.Buffer：含Mg2+，10×，-20℃保存； 4.dNTP：保存液为25mM，使用前用ddH2O稀释为2.5mM并分装，避免污染，-20℃保存。 5.引物：引物干粉在溶解前先12,000rpm离心2min，再用ddH2O溶解至10μM，涡旋震荡使其充足溶解，-20℃保存； 6.模板。 7.Taq DNA聚合酶：-20℃保存。 实验准备 1.预订PCR仪，填写好使用时间； 2.制冰； 3.将所需试剂解冻、混匀、瞬离，置于冰上，模板要放在冰上解冻。 环节： 1.设计实验，认真阅读有关试剂阐明书。 2.将离心管置于冰上，按照以下体系加入样品。加样次序为：ddH2O→Buffer/dNTP/引物/模板。 Taq DNA聚合酶反映体系（25μL） 试剂 用量（μL） ddH2O 18.375μL Buffer （Mg2+，10×） 2.5μL dNTP（2.5mM） 2μL 引物（正向和反向，10μM） 各0.5μL 模板DNA 102~105copies Taq DNA聚合酶* 0.125μL * 注意：加酶之前将酶拿出放冰上，使用完立刻放回冰箱。 3.在离心管盖上写好每个样品的编号，瞬离。 4.设立好PCR程序，待反映温度达成实验需要时，将样品放入PCR仪，尽量放在中央的孔。 5.将试剂放回原处，移液器调回最大量程，整顿实验台。 6.反映结束后，及时停止PCR程序（不要停在4℃太久），取出样品，关好PCR仪。 四、 其它注意事项： 1.对的使用移液器、离心机和PCR仪； 2.手或移液器不要接触反映管或试剂瓶、管的内壁、盖内侧； 3.不使用枪头时，盖好枪头盒盖； 4.枪头只能使用一次； 5.合理设计实验，使用适宜的阴性对照很重要，如：使用不加DNA的材料进行PCR扩增，以证明缓冲液或其它试剂中与否存在任何可影响PCR的污染物； 6.如果一次实验需做多管样品，尽量先配制mix，由于存在液体混合后的体积变化和挂液，计算mix用量要比实际管数多某些； 7.反映在PCR仪进行期间，最佳能检查一下程序与否在正常运行，及时发现异常。 3.2 移液器的使用办法 1.调节量程：轻轻旋转量程调节圈，注意不要超出量程。建议从高到低调节量程，必要时，可旋转量程调节圈稍超出所需数值，再向回旋转，移液能够更精确。 2.装配枪头：轻轻按压，将枪头盒上的枪头装配到移液器。 3.吸液：按下操作键至一档（设定体积），将枪头垂直浸入液体约4mm；让操作键慢慢复位，此过程中保持枪头浸入深度，避免吸入空气；将枪头慢慢移出液面，并确保枪头外壁无残留液体。（建议每个新枪头先通过一到三次的吸液和放液来润湿，有助于提高移液精确度。吸取大致积液体时，将枪头保持浸入状态约3秒钟，再移液。） A B 图3.2.1 移液器的吸液（A）和放液（B） 4.放液：将枪头倾斜地紧贴管壁，将操作键慢慢按向一档（设定体积），等待，直到不再有液体流出；将操作键按向二档（吹液），将枪头完全排空；仍然按住操作键，在管壁上擦拭枪头；在管外，慢慢让操作键复位；按下脱卸键卸掉枪头。 5.其它注意事项： （1）轻拿轻放，使用后调回最大量程； （2）保持移液器干净。 （3）与水有很大物理性差别的溶液，或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液，可能会造成移液不准，要注意检查移液体积。 3.3 PCR反映原理及过程 3.3.1 反映原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，是运用 DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反映温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链（图3.3.1）。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一种温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间较好地进行控制。 3.5.2 反映过程 PCR由变性--退火--延伸三个基本反映环节构成（图3.3.2）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反映作准备；②模板DNA与引物的退火（ 复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的 互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反映原料，靶序列为模板，按 碱基互补配对与