生化实验报告2.docVIP

实验二 蛋白质含量的测定 一、实验目的 1.学习微量凯氏定氮法的原理。 2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含氮量的测定、未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。 二、实验设备及材料 1. 所需试剂 （1）硫酸铜 （2）硫酸钾 （3）浓硫酸 （3）氢氧化钠 （4）硼酸 （5）盐酸 （6）溴甲酚绿 （7）95%乙醇 （8）甲基红 （9）无水碳酸钠 （10）蒸馏水 2. 仪器 1） BUCHI定氮仪（型号）、消化炉（型号）及消化管、消化管架、消化管夹 2） 超声波清洗机 3） 塑料桶 4） 电子天平（0.1mg） 5） 称样勺 6） 烧杯 7） 玻璃棒 8） 1000ml或2000ml定容瓶 9） 电炉 10） 酸式滴定管 11） 马弗炉 12. 250ml锥形瓶 13. 胶头吸管 14. 棕色小瓶 15） 10ml移液管 16） 洗耳球 17） 50ml定量瓶 三、实验原理、内容、步骤 1. 原理： 天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。 当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氮蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。 以甘苷酸为例，该过程的化学反应如下: 1. CH2-COON │ ＋3H2S04→2C02＋3S02＋4H20+NH3 NH2 2. 2NH3十H2S04→(NH4)2SO4 3. (NH4)2S04+2NaOH→2H2O+Na2SO4＋2NH3↑ 测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。 本法适用的范围为0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于±2％。 2. 基本试剂配制 （1）催化剂：硫酸铜 0.5g＋硫酸钾3.0g/支管； （2）0.2％溴甲酚绿溶液：95%乙醇溶液作溶剂，即0.2克溴甲酚绿加入100ml 95%乙醇中（或?0.1克：50ml） （3）0.2％甲基红溶液：95%乙醇溶液作溶剂；即0.2克甲基红计入100ml 95%乙醇（或?0.1克：50ml） （4）40％氢氧化钠溶液：8瓶500g的NaOH倒入塑料桶中，然后加入5kg蒸馏水，不断搅拌，放凉澄清后补充给机器自带的桶，不要让管子里有气泡； （5）0.01mol/l 盐酸滴定液：量取9ml盐酸，加适量水并稀释至1000ml。混匀，待标定。 3. 实验试剂配制 （1）催化剂：硫酸铜 0.5g＋硫酸钾3.0g/支管； （2）1％硼酸溶液：要盖住，最好2周用完或用塑料桶装； （3）指示剂：5份0.2％溴甲酚绿-乙醇溶液与1份0.2％甲基红-乙醇溶液混合；酸性显红色，中性显葡萄紫色，碱性显绿色。 4. 实验步骤 1. 称样： 称取0.5克干样品于消化管中，每管加入催化剂硫酸铜0.5克和硫酸钾3.0克，再加入10毫升浓硫酸。 2. 消化 机器设定： 3. 蒸馏 机器设定： 锥形瓶中加入50ml 1％硼酸溶液和3滴指示剂，变蓝色，把接收管插入液面之下，启动蒸馏程序，开始接收。 4. 滴定：用标定过的标准盐酸液滴定接收瓶，终点时放慢滴定速度，当液体无色时停止，静止一会变成淡红色即到达终点。 蛋白质测定表格： 时间： 测定人： 编号 样品类型 样品重g HCl用量（ml） HCl浓度（mol/l） 1 空白 2 空白 3 4 5. 计算 （1）样品的总氮含量（克氮/%）=[（A-B）×N×14/m×1000]×100 注：“空白”滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氮。因此，水质对“空白”滴定值的影响甚大。“消化样品”最后用“消化空白”进行校正计算，“不消化的样品”最后用“不消化的空白”进行校正计算。而且，在实脸中，稀释样品的水与“空白”的应取自于同一瓶中。 （2）样品中的蛋白质含量（克/%）=（A-B）×N×14×6.2500×100/m×1000 式中: A：为滴定样品用去的盐酸平均毫升数; B：为滴定空白用去的盐酸平均毫升数; m：为称量样品的克数; N：实验中使用盐酸的实际浓度; 14：为氮的原子量; 6.25：为系数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。 附：盐酸标准滴定溶液（0.1mol/L）的标定(GB/T5009.1-2003) （1）标定：