基因重组完整版.ppt

基因重组 一、基因重组的概念 基因重组是一段DNA在细胞内或细胞间甚至在不同物种DNA之间进行交换和重新组合。 同源重组（姐妹染色体交换） DNA损伤时重组频率增高 转化：是指外来DNA引入细胞引起遗传性的改变。 转染：是指噬菌体感染时其DNA进入细菌体内。 转导：是指噬菌体将细菌的一段DNA代入另一个细菌。 　 （一） 接合作用（conjugation) 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。 　 　 　 （二）转化作用（transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 　 （三）转导作用（transduction) 当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。 　 　 　 （四）转座（transposition) 大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的 DNA序列包括插入序列和转座子。由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。 　 （一）插入序列转座 插入序列（insertion sequences，IS）：长750 ~ 1500bp 组成：反向重复序列：9~41bp，位于两侧 转座酶编码基因：产物引起转座，位于中间 正向重复序列：4~12bp，位于反向重复序列外侧，为插入序列所特有 　 插入序列转座： 1. 保守性转座 从原位迁至新位 2. 复制性转座 插入序列复制后，一个复制本迁到新位，另一个保留在原位。 　 　 　 （二）转座子转座 转座子（transposons）：可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。 　反向重复序列 组成 转座酶基因 　特殊基因：如抗生素抗性基因等 　 （五）同源重组 发生在同源序列间的重组。同源重组不依赖特异DNA序列，而依赖同源性。 同源重组需要一些重组蛋白和酶。如Rec A、B、C、D及DNA连接酶等。 　 　 二、基因工程 1.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组 目的基因 载体DNA 限制性核酸内切酶 DNA 重组体 引入宿主细胞 筛选含有重组体的细胞 无性繁殖扩增、基因表达、纯化产物 2.转化或转染 3.筛选 4.克隆（cloning）、表达 （一）目的基因的获得 1.直接从DNA中分离目的基因 2.分离mRNA，逆转录合成cDNA 3.用DNA合成仪人工合成目的基因 4 .从基因文库（gene library）中筛选出目的基因 从细胞中提取全部mRNA 反转录合成cDNA并复制成双链的DNA 与质粒重组并引入大肠杆菌即为cDNA文库 将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段 与质粒重组并引入大肠杆菌即为G-文库 重要工具酶——限制性核酸内切酶 选用II型限制酶，能专一识别和切割双链DNA 限制酶的命名 Haemophilus influenzae d 嗜血杆菌属 流感杆菌（种名） 株名 取H 取in d Hind I Hind II Hind III Hind III 5’—AAGCTT— 3’—TTCGAA— 5’—A AGCTT— 3’—T TCGA A— 识别六核苷酸序列 产生粘端切口 Sma I 5’—CCCGGG— 3’—GGGCCC— 5’—CCC GGG— 3’—GGG CCC— 产生平端切口 二、DNA重组（目的基因与载体重组） 重组 5’—A 3’—TTCGA— AGCTT— A— 目的基因粘端 运载体DNA粘端 5’—AAGCTT—3’—TTCGAA— DNA连接酶 退火 末端转移酶 粘端连接 平端连接 三、重组体引入受体细胞 转化、转染、感染或直接引入 四、重组体的筛选与鉴定 1.利用抗药基因进行初筛 2.限制酶切图谱分析（指纹图谱法） 提取重组体DNA提取运载体DNA 限制酶切，琼脂糖凝胶电泳 电泳区带比较 （指纹图谱） 3.标记探针核酸杂交鉴定 探针是与待测定基因DNA序列互补的寡核苷酸链 标记探针是用放射性同位素如此32P或用非放射性物质标记 转基因植物获得新的性状