分析化学实验报告8. Cyt.C-2013-1126.docVIP

PAGE PAGE 3 实验七 细胞色素c的制备及其测定 [目的和要求] 掌握细Cyt. c的制备原理及含量测定方法。 [实验原理] 细胞色素是多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。 1). 作用：Cyt. c是呼吸链中极重要的电子传递体。它主要存在于线粒体中，在需氧较多的组织如心肌及酵母细胞中，Cyt. c含量丰富。 2). 结构： Cyt. c为含铁卟啉的结合蛋白质，相对分子质量约为12 000～13 000 Dr.，蛋白质部分由约104个氨基酸残基组成, 等电点pI为 10.4左右。 Cyt. c易溶于水和酸性溶液，故可从酸性水中提取。 Cyt. c可分为氧化型(深红色)和还原型(桃红色)两种。 细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸可使之变性失活。 3). 光吸收特性：氧化型Cyt. c的最大吸收峰：480nm, 530nm。 还原型Cyt. c的最大吸收峰：415nm, 520nm, 550nm。 4). 制备原理：本实验以新鲜猪心为原料，经酸溶液抽提，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀，得到Cyt.c粗制品，经分光光度法测定其含量。 工艺原理： [实验器材] 捣碎机，离心机，磁力搅拌器，可见分光光度计，玻璃层析柱，透析袋，玻璃器皿。 [实验材料及试剂] (1) 新鲜的猪心。 (2) 人造沸石（ ）过60—80目筛。 (3) 0.2％NaCl溶液，25％(NH4)S04溶液，12％BaCl2溶液，20％三氯乙酸(TCA)溶液，连二亚硫酸钠等。 (4) Cyt.c标准液浓度: 3 mg/mL。 [实验步骤] 1．提取 称取新鲜猪心71 ① 称取心肌肉糜100g，加水150mL，置l 000 mL烧杯中，加入2M H2SO4，调pH至4.0 (呈暗紫色)，室温用磁力搅拌器提取1h。 ② 用2 M NH4OH调pH至6.0，3000rp, 离心15’ ③ 收集红色上清液调pH至7.5, 置4℃ 2．吸附及洗脱 ④ 若4℃冰箱储存液有沉淀用纱布过滤，收集红色滤 ⑤称取人造沸石15g 于150mL烧杯内，加入150ml蒸馏水，用浓硫酸（约15滴）调pH至中性。倒去上层混浊液，加入蒸馏水轻轻搅拌，再用2mol/L硫酸细调pH=7.0～7.5。 倒入Cyt.c粗提液，磁力器搅拌经人造沸石柱吸附40~1h，随着Cyt.c被吸附，人造沸石逐渐由白色变为红色。 ⑥吸附完毕，将红色人造沸石转至100mL烧杯中，先用蒸馏水洗涤至水清（约4次），然后用60 mL 0.2％NaCl溶液分两次洗涤，再用蒸馏水洗涤至水清。 ⑦将人造沸石装柱（1.6 X 20cm）。连接恒流泵（流速控制在3mL／min），25％(NH4)S04溶液洗脱（流速控制在2mL／min, 液量少于50mL）。收集红色洗脱液(洗脱液一旦变白，立即停止收集)，洗脱完毕，人造沸石可再生使用。(第二次实验毕)。 3．盐析及浓缩 在上述洗脱液中按20% 慢慢添加入固体硫酸铵[（NH4）2SO4]，边加边搅拌，使硫酸铵溶液质量浓度为45％(约相当于67％的饱和度)，静置30min, 3000rp，离心15’ 在搅拌下，按每100 mLCyt.c滤液：4 mL TCA(20％三氯乙酸)比例，沉淀Cyt.c，并立即3000 rp, 离心15 min，倾去上清液。 收集沉淀，加2.5mL蒸馏水，使沉淀溶解，装入透析袋，于500 mL烧杯中，在磁力器搅拌下用蒸馏水透析，5min换水一次，换水3～4次后，检查SO4-是否被除净(方法：取2 mL透析外液，滴加2～3滴乙酸钡，若出现白色沉淀, 表示SO4- 存在；若无沉淀出现，表示透析完全)。量取并记录透析后Cyt.c的体积。 4．Cyt.c含量的测定 取透析后Cyt.c 0.5mL，加3.5mL水进行比色。因本法制备的Cyt.c是氧化型和还原型的混合物，测定含量时要加入少许连二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型Cyt.c变为还原型。 还原型Cyt.c水溶液在波长520 nm 处有最大光吸收。 根据这一特性，绘出Cyt.c浓度和相应的吸光度的标准曲线，然后根据所测溶液的吸光度，由标准曲线求出所测样品的含量。 [结果计算] 1.标准曲线的制作：数据如下表所示： C A 520nm 0 0 0.6 0.146 1.2 0.303 1.8 0.470 2.4 0.613 3.0 0.724 标准曲线公式：y = 0.247 x + 0.0054 ∴ x = (y -0.0054)/0.247 2. Cyt.c的含量的计算： [注意事项] 1．尽量除尽猪心非