卷柏属药用植物鉴别及亲缘关系分析.docxVIP

卷柏属药用植物鉴别及亲缘关系分析 柏树属植物属于蕨类植物门石松科。这是一种多年生草本植物。在世界上大约有700种。在中国，分布了60-70多个地区，其中22种具有药用价值。现代药理研究表明:卷柏属药用植物不仅具有传统的清热解毒作用,还具有抗肿瘤、降血糖、抗病毒、止血、免疫调节等多种功能。由于该属某些植物的形态较为类似,鉴别时容易引起混淆。近年来分子标记技术被引入中药鉴定研究,以与形态组织学和化学分析方法得到的结果进行验证。其中RAPD分析是一种有效的DNA分子标记方法,对亲缘关系分析有良好效果。因此,本文在用形态、组织和化学方法进行鉴定研究的基础上,对8种卷柏属药用植物进行分子标记研究,探索彼此间的亲缘关系和遗传距离,了解其变异程度,为卷柏属药用植物的鉴定和资源合理开发提供参考依据。 1 材料和试剂 1.1 新鲜叶片的采集和干燥 实验材料样品的采集地点和时间见表1,每份样品采集6~10株植物的新鲜叶片,用硅胶快速干燥保存。样品的植物学名由万定荣教授鉴定,采集的标本留存于湖北中医学院标本室。 1.2 pcr扩增检测 仪器:TGL-16G型高速离心机(上海安亭科学仪器厂):DYY-6B型电泳仪(北京市六一仪器厂):GENEAMP 5700PCR扩增仪(APPLIED BIOSYSTEMS,美国);MGIAS-1000D多媒体凝胶成像分析系统。试剂:琼脂糖(Promega公司);SYBR-Greenl(达科为生物技术有限公司);随机扩增引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Marker(100bp-3000bp)、CTAB(上海Sangon公司);Tris(Amresco)。 2 方法和结果 2.1 相关乙醇的提取 取干叶片约50 mg,置1.5 ml Ep管中,加入液氮研碎,立即加入500 μl预热至56℃的2×CTAB提取缓冲液[CTAB2%,Tris-HCl(pH8.0)100 mmol/L,EDTA20 mmol/L,NaCl 1.4 mol/L,巯基乙醇2%]及巯基乙醇20 μl混匀,56℃水浴保温30 min,其间轻微翻动浮板三次;加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提,轻轻颠倒混匀,12000 r/min离心10 min,吸取上清液,加入0.1倍的10%CTAB溶液,室温下放置10 min,再用氯仿-异戊醇(24∶1)抽提一次;取上清液加入等体积的1×CTAB沉淀缓冲液[CTAB1%,Tris-HCl(pH8.0)50 mmol/L,EDTA 10 mmol/L,巯基乙醇1%],室温下放置3 h;12000 r/min离心30 min,小心去掉上清液,分别用65%乙醇和85%乙醇各洗涤2次,然后于60℃烘箱中干燥30 min。加入TE缓冲液溶解DNA,存于-20℃冰箱备用。 2.2 pcr检测dntp、taq酶、dna模板 反应体系:总体积为25 μl,其中10×PCR buffer 2.5 μl,Mg2+(20 mmol/L)1.9 μl,引物(20 μmol/μL)1 μl,dNTP(10 mmol/L)0.5 μl,Taq酶(5U/μl)0.3 μl,DNA模板(50 ng/μl)0.5 μl,ddH2O18.3 μl。 扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性45s,36℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,40个循环,72℃后延伸5 min。扩增产物加入1%的荧光染料SYBER-Green l 于2%琼脂糖凝胶上用1×TAE缓冲液电泳,在凝胶成像分析系统上观察并拍照。 2.3 强、重复性引物 从60个10 bp随机引物中,筛选出扩增性强、重复性好、多态性明显的8个引物,用于全部卷柏属样品基因组DNA的扩增。所用引物序列见表2。 图1、2为卷柏样品的两个扩增图谱。 2.4 相似系数的计算 对每一个样品根据在凝胶上同一位置所扩增的DNA条带的有或无分别标记为1或0(条带存在为1,条带不存在为0),在相同条件下,迁移相同的条带视为同源位点,统计的二元数据用SPSS11.5分析软件中的Jaccard方法计算样品间的相似系数,用Withingroups linkage聚类方法分析,得到各样品的亲缘关系树系图(图3)。 8个引物共扩增出58个条带,见表2,扩增产物多集中在100~1500 bp。 3 讨论 3.1 高盐低ph值法提取方法的确定 在提取总DNA时,比较了文献介绍的CTAB法与高盐低pH值法,发现CTAB法对新鲜样品的提取效果优于高盐低pH值法。最终选择了改良CTAB法,操作简便,易于提取,扩增条带较清晰。在提取时,抽提液一般使用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),但实验中发现不用酚也能完全达到要求,含有酚的话反而会因其残留问题影响后面的实验过程,故抽提液选择为氯仿-异戊醇(24∶1)。 3