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信号肽对外源蛋白分泌效率的影响 即使是真实的核或原核细胞，分泌性蛋白质也必须在合成后离开细胞和积累。一般而言,决定蛋白质命运的是蛋白N端一段额外氨基酸序列,即信号肽或信号序列(signal peptide or signal sequence)。初生蛋白正确定位后,信号肽被信号肽酶水解,初生蛋白释放,经过折叠等立体构象的变化,转变为成熟的蛋白质。本文对信号肽研究的现状和进展进行综述。 外源蛋白的纯化需要该蛋白自细胞中高效地分泌,目前研究认为,该过程最重要因素之一,是选择适宜的信号肽序列。目前研究采用外源蛋白自身信号序列或外源信号序列,或两者兼而有之。一般信号肽具有以下特征: 1 信号肽agt基因序列及eg基因的整合 信号肽假说认为,蛋白质之所以能跨膜送输,主要是因为信号肽中存在的疏水结构。有人研究酵母phoA信号肽疏水核心Leu:Ala比值时发现,当Leu:Ala为6∶4时,前体蛋白分泌加工能力最高,在此比值附近,信号肽分泌加工能力随疏水性增强而提高,此时,前体蛋白质可以不依赖分子伴侣或其它辅助因子也能较好分泌。由此,可以推测将强疏水核心的信号肽序列在合适位点与外源基因融合后,可以促进重组蛋白分泌,获得稳定且便于纯化的重组蛋白。 合成了一段具有10个Leu强疏水核心的信号肽ASP(artificial signal peptide),在EcoRI_Kpn位点处与青霉素G酰化酶(penillicin G acylase PAC)野生型信号肽(wild type signal peptide,WTSP)序列融合。实验结果表明,强疏水核心的信号肽ASP使平均83.5%PAC前体表达产物有效分泌至周质空间,比野生型信号肽WTSP提高了约41%,可见PAC的高效分泌依赖于具有强疏水性的信号肽。 2 采用主枝细胞信息交换剂 2.1 外源基因表达 信号肽没有严格专一性,因而可利用宿主细胞自身信号序列分泌外源蛋白。如大鼠胰岛素原如果接上原核细胞信号肽,就能通过E.coli的质膜分泌到胞外。以E.coli分泌信号OmpA构建一株高表达分泌型重组人生长激素(hGH)基因工程菌,其表达产物与天然hGH一致。 以酵母为表达载体,高密度发酵可获得足量人源性重组蛋白,且发酵产物没有大肠杆菌中常见的内毒素,在临床治疗方面有重要作用。一般而言,外源信号序列虽可以引导蛋白分泌,但效率较低。因此,在一定程度上,需要依赖酵母本身的分泌信号肽来指导外源基因表达产物的分泌。常用的酵母信号肽有存在于酸性磷酸脂酶(PHO5),蔗糖酶(SUC2)和α因子(MFα1),Killer毒素等中的内源性信号肽,其中以α因子信号肽应用最广。研究显示,在α因子中间插入EEAEAEAEPK10个氨基酸,新的信号序列可提高胰岛素在毕赤酵母中的分泌。 2.2 外源基因的切割 α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽及后面一段由lys_Arg(Glu_Ala)1-2或Lys_Arg_Glu_AlaAsp_Ala氨基酸序列组成的间隔肽。膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别lys_ArgC端,STE13基因产物则识别(Glu_Ala)1-2或Asp_Ala外侧。前导肽和间隔肽对蛋白的正确切割和分泌至关重要,但有时由于上述两种基因产物的切割活力不同,会在外源蛋白的N端产生不同的切割位点,使一些分泌的蛋白N端带有(Glu_Ala)1-2融合序列,即产生了所谓的酵母信号肽切割不完全现象。 酵母细胞中α因子蛋白质前体的成熟加工,就发生在α因子与启动子基因编码的第85个密码子(精氨酸密码子)处,在加工过程中,α因子的前导肽被切除,但释放的α因子氨基末端仍带有4个多余的氨基酸残基,可能与酵母的二氨基肽酶的活力不足有关。如果适当改变酵母信号肽,可获得与天然蛋白一致的氨基酸序列。吴瑞实验室在构建载体pYA_4时,预先除去前导肽编码顺序第85密码子下游的4个密码子,并在第85个密码子处重建一个HindIII位点(便于与外源基因的编码直接相连)。利用这种载体表达外源基因,分泌到介质中的成熟蛋白不含多余的氨基酸残基。 毕赤酵母中克隆表达人三叶因子3(hTFF3),可在正向引物中加入α因子信号肽酶切序列,反向引物中删去表达Glu_Ala的基因序列,从而表达出了与天然hTFF3N端序列一致的蛋白。 可见,对宿主细胞的信号序列,并不一定能直接引用,尤其是酵母系统的信号切割不完全情况,需要对其做适当改变。引用外源信号肽时,同样需要考虑这一点。最佳选择是找出适当的信号肽,使其不仅能在酵母系统中引导外源蛋白高效分泌,同时还能被信号肽酶准确识别。 3 酵母信号肽的作用 近年来,人们研究外源蛋白分泌时,发现了很多有趣且实用的分泌信号,能较大地促进外源蛋白分泌,如H.Uchida等在编码hGH序列的下游,融合了杆菌的中性淀粉蛋白水解酶基因(n