水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定.pptx

细菌菌落总数的测定 ;教学内容;教学目标;一、细菌总数是水质污染的重要指标;二、稀释平板培养计数法;1.测定的程序： 　　样品稀释 　　接种平板 　　培养 　　菌落计数 　　报告;2.材料准备： 　培养皿、试管、移液管、锥形瓶等玻璃器皿的灭菌； 　制作营养琼脂培养基： 　　蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g，水1000mL；pH7.4~7.6，121℃灭菌15min。 　制备无菌水。;3.无菌操作 （1） 保证除样品外所有需使用的材料无菌 （2） 无菌操作环境 　　净化工作台：紫外灯提前开放0.5h以上，放入样品与材料需70%酒精表面消毒 　　开放空间：减小空气流通（闭窗、减少人员走动等）；喷洒70%酒精净化空间；在酒精灯火焰上方无菌区操作（高度以不烫手为宜）;（3） 无菌操作规范 　　试管、锥形瓶等无菌用具在无菌区打开，在此范围外必需封闭（基本原则），在无菌区外污染后不得再次使用； 　　接种工具、涂抹棒等灭菌后即时在无菌区使用，区外污染后需再灭菌使用（注意灭菌后需在无菌区冷却后使用，以免烫死微生物而取不到到活的微生物）。;　1. 分装无菌水 　取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水或无菌生理盐水。 　（也可分装好后再灭菌） 　稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。;2. 梯次稀释 　取混匀水样1ml放入标记10－1试管中，充分振荡混匀，得10－1稀释液； 　取10－1稀释液1ml放入标记10－2试管中，充分振荡混匀，得10－2稀释液； 　……，依次稀释到所需稀释浓度。;3. 注意事项 　取液量保证准确； 　稀释样要充分混匀； 　保证无菌操作（防止外源污染），但加样时注意不要太近火焰（杀死其中微生物）。;1.培养数量 　不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2个培养，每个培养需培养3个平板（重复）； 　需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板（重复）； 　预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操作人、时间等信息。;2. 接种平板 2.1 混合平板法 　取各稀释样（无菌水）1ml放入无菌培养皿中，3个重复（可在稀释的操作同时取）； 　倒入适温培养基（50℃左右，冷却到不烫手为宜），每皿培养基倒入量一般9cm培养皿15ml左右（培养皿平放时倒入一半至2/3面积左右）； 　混匀（倒培养基时培养皿适度倾斜，桌面适度旋转，但不得使培养基附着到培养皿侧面）； 　静置冷却成平板，翻转放置。 ;2.2 平板涂布法 　先制作平板； 　取样品（无菌水）0.1ml放入平板上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至无残存样品（无菌水）； 　翻转放置。;2. 3注意事项 　保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得太烫，取样时不要离火焰太近）； 　制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得翻转； 　不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染； 　平板涂布法中，最好先在净化工作台中提前制作平板，并放置一段时间（2d左右），以使表面稍干燥便于涂布。;3.培养 　培养温度为36℃，培养时间24h； 　选用普通电热恒温培养箱，也可选用生化培养箱或霉菌培养箱； 　平板培养基一面朝上，不可颠倒； 　根据培养时间要求及时取出进行后续处理。;1. 菌落计数方法 　观察方法：直接肉眼观察计数，必要时用放大镜、菌落计数仪观察，防止遗漏。 　特殊情况的处理： 　　若某平板有较大片状菌落生长且超过一半面积时，此平板则不宜作计数用； 　　片状菌落小于一半面积，且其余菌落分布又很均匀时，可取平板一半面积计菌落数，再乘以2得本平板菌落数。;2. 不同稀释度的 　选择与报告;3. 报告方式 　菌落数在100以内，按实际数据报告； 　大于100时，采用2位有效数字，在有效数字后的位数，以四舍五入方法计算； 　数值较大时，数字后可用10的指数表示。;四、任务考核