昆虫线粒体基因组研究方法ppt课件.pptxVIP

昆虫线粒体基因组研究方法 一.昆虫线粒体基因组的研究意义 · ( 一 ) 适合做进化生物学研究。被广泛用 于研究基因组结构和功能、群体遗传结构， 谱系地理学和各种分类学水平上的系统发 育关系研究。 · (二)功能基因的研究 二.研究方法 · (一)获取待研究昆虫的线粒体基因组 · (二)对线粒体基因组结构进行分析 · (三)与其他昆虫线粒体基因组进行比对 · (四)进行系统发育分析 具体步骤 ·1 .采集标本并冷冻 · 2.提取DNA · 3. 扩增线粒体基因组上的经典片段 · 4. 设计引物，扩增其他片段 · 5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组(环形) ·6.校对数据，利用软件、比对等方法，标出tRNA、 16S、12S 及13个蛋白质基因的位置，上传线粒 体基因组数据至Genbank。 · 7.对tRNA 进行结构预测 · 8.对12S 及16S 进行结构预测 · 9. 对该昆虫线粒体基因组上特殊位置进行讨论 · 10. 系统发育分析 1.采集标本及冷冻 利用高压汞灯及黑光灯诱集，然后将标 本低温冷冻致死，取一侧后足泡入无水乙 醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。 标 本展翅并保存，以待进一步形态鉴定。 2.DNA 提取 总DNA 提取试剂盒为德国默克公司 QIAGEN DNeasy Tissue kit。PCR试剂使 用TIANGEN天根生化科技有限公司生产的 PCR MasterMix。 将浸泡于无水乙醇中的足取出，晾干， 分成2-3段，放在1.5ul的离心管中。按照 QIAGEN DNeasy Tissue kit使用手册的说 明进行总DNA提取。抽提的DNA溶于200- 300ul的AE 缓冲液，并置于在-20℃冰箱保 存备用。 3.PCR 扩增和测序 · 先扩增线粒体基因组上的经典片段，如COI、COⅡ、 COⅢ 、Cob等。 · 例：扩增COI基因片段 · 扩增引物为通用引物LCOI490(5- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3) 和HCO2198 (5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3)( Folmer et al,1994)。 反应体系为25μl, 其中上下游引物 各0.5μl,PCR MasterMix 12.5μl,DNA模板3μl,ddH2O 8.5μl。 扩增反应条件：预变性94℃2分钟，变性94℃ 分钟，退火50℃1分钟，延伸72℃1分钟，进行35个循环。 取3μl PCR扩增产物使用1%的琼脂糖胶电泳检验。 PCR 产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 4.设计引物，扩增其他片段 · 利用软件Primer5.0 设计引物，扩增其他片段。最 难扩增的片段是控制区 (A+T-rich)。 因为引物 很难设计，所以需要花费一些时间及精力。 W Eupolyphaga sinensis 15553 bp H F G ESN L(uR) L(a S(ucn) T (UCN) Eupolyphaga 15553 T sinensis bp nad5 ATrich nad2 K0 (UUR) 5.将所有片段拼接成完整的线粒体组(环形) · 利用软件DNAstar 对扩增好的各个片段进行 拼接。用Bioedit 软件查看测序原始峰图， 校对各个碱基。将校对好的数据上传至 Genbank。 获取Genbank 的accession number。 6. 寻 找tRNA 及 预 测tRNA · 用tRNAscan-SE Search Server 在线软 件，寻找tRNA, 一次 可找出17-19 个。其余 与其他昆虫线粒体进 行比对找出。 · 用DNAsis 预测tRNA 结 构，对于较为特殊的 tRNASer(AGN), 需手 工画出。 结 构 · 用软件XRNA进行预测。 预测不到的，用手工 画出。 7. 预 测 1 2S 及 1 6S 结 构 8.对特殊结构进行分析讨论 ·例：控制区的结构分析 · 在线软件 Mfold Web Server (Zuker, 2003; /?q =mfold) TATTGTAAAAAATATAAAATAGArTT-A TATTATAATAAATTTATATATATG(TA)1o motif TTAAT …TATTAT … …ATACA(TA):TTAAT … …TATTAT … …ATACA(TA)r 154bp