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高效液相色谱法测定猪组织中替米考星 代米考星是美国科学院在20世纪80年代开发的一种特殊的抗癫痫药物。这种异构体在85.15的比例上混合。替米考星对所有的革兰阳性菌和部分革兰阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用, 临床用于敏感菌所引起的感染性疾病, 特别是畜禽呼吸道感染, 替米考星作为饲料添加剂连续使用14 d防治由放线杆菌和巴氏杆菌引起的猪细菌性肺炎。猪组织中替米考星残留的高效液相色谱 (HPLC) 检测方法国内未见报道, 国外报道多采用苯基色谱柱、反相梯度洗脱HPLC方法, 如Carolyn等的HPLC方法。梯度洗脱的目的是将药物与基质成分分离, 使用苯基色谱柱, 可将替米考星的顺式和反式异构体洗脱成一个峰, 从而提高响应因子和灵敏度, 但此方法对色谱仪器要求较高, 不利于推广。Ramadan等用枯草杆菌微生物学法测定羊血和乳中的替米考星残留, 但微生物学法灵敏度较低, 专属性差。本研究旨在建立猪组织中替米考星残留的HPLC检测方法。 1 材料和方法 1.1 标准品的配制 高效液相色谱仪, 装备有SCL-10 Avp系统控制仪, DGU-10 A脱气装置, SPD-M10 Avp紫外检测器, LC-10 ATvp泵, 日本Shimadzu公司;固相萃取 (SPE) 柱, BondElut, C18, 500 mg/6mL;替米考星标准品 (含量90.7%) , 由美国礼来 (Lilly) 公司提供;乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯, 购自DIKMA公司;二丁胺、乙酸铵、磷酸二氢钾、85%磷酸均为分析纯, 购自北京化学试剂公司。 1.2 主要溶液的制备 1.2.1 标准储备溶液2mg，ml 准确称取100.0 mg替米考星标准品于50 mL棕色容量瓶中, 用乙腈溶解并定容。密封, 用铝箔包好, 4 ℃避光保存。 1.2.2 加边搅拌、搅拌 将700 mL 10%磷酸溶液加到168 mL二丁胺中, 边加边搅拌。待溶液冷却至室温后, 用85%磷酸调pH至2.5, 加纯水定容至1 000 mL, 配制成二丁胺磷酸缓冲液 (1 mol/L贮备液) 。该溶液很稳定, 但变成棕色则不能使用。 1.2.3 磷酸缓冲液配制 分别量取130 mL乙腈, 55 mL四氢呋喃, 25 mL二丁胺磷酸缓冲液 (1 mol/L贮备液) 加到700 mL纯水中, 用纯水定容至1 000 mL, 0.2 μm滤膜过滤。配制前各组分要真空脱气, 配制后不能再脱气。使用时密封, 以防止流动相中有机溶剂挥发。 1.2.4 乙酸铵甲醇-乙腈溶液的配制 准确称取7.71 g乙酸铵溶解于200 mL甲醇中, 加入790 mL乙腈混匀, 待溶液恢复室温后, 用乙腈定容至1 000 mL, 配制成0.1 mol/L乙酸铵甲醇-乙腈溶液 (20∶80, 体积比) 。 1.2.5 kh2po4溶液 准确称取13.61 g磷酸二氢钾 (KH2PO4) 溶解于800 mL纯水中, 用85%磷酸调pH至2.5, 再用纯水定容至1 000 mL。 1.3 色谱及色谱柱 检测器:光二极管阵列检测器 (PDA) ;检测波长:290 nm;色谱柱:Inertsil, ODS反相色谱柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm粒径) ;流动相:见 1.2.3;流速:1.0 mL/min。 1.4 标准工作曲线绘制 用流动相将替米考星的标准贮备液稀释成0.02、0.05、0.1、0.5、5.0、10.0、25.0 μg/mL的标准工作溶液, 各取100 μL进HPLC分析, 以浓度为横坐标, 峰面积 (顺式和反式异构体的峰面积之和) 为纵坐标绘制标准曲线。 1.5 spe柱的制备 将猪肌肉和肝脏剪碎、匀浆, 准确称取5.0 g组织, 置于50 mL聚丙烯离心管中, 加8 mL乙腈, 涡动混匀, 中速振荡20 min, 3 500 r/min离心10 min, 取上清液置于100 mL聚丙烯离心管, 向组织凝块中分别加5 mL磷酸二氢钾缓冲液和8 mL乙腈, 搅拌使组织凝块散开, 涡动混匀, 中速振荡20 min, 3 500 r/min离心10 min, 合并2次上清液于100 mL聚丙烯离心管中, 加40 mL水, 3 500 r/min离心10 min, 取上清液于适当容器中, 加10 mL水混匀, 过SPE柱。 将SPE柱置于固相萃取真空歧管装置上, 10 mL甲醇活化和10 mL水平衡SPE柱, 当样品通过SPE柱时, 调整真空泵的压力使流速约1滴/s, 10 mL水洗涤, 再用10 mL乙腈洗涤, 流速1滴/s, 乙腈从SPE柱流出后, 将真空泵的压力调小, 让SPE柱在真空下干燥至少3 min, 2.5 mL洗脱液洗脱于刻度试管中, 30 ℃水浴中氮气吹至近干。流动相稀释定容至1